研究背景及目的： 痛风是因嘌呤代谢障碍和／或尿酸排泄减少、血尿酸持续升高而导致尿酸钠(MSU)结晶析出并沉积于组织或器官引起的一组临床症候群。有研究显示炎症与免疫在痛风的发病中具有一定的作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)是固有免疫的重要成员,其可以识别MSU形成活化的NLRP3炎性体,进而引起IL-1β等的成熟和释放而引起炎症反应。已知Pre-mRNA的选择性剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,选择性剪接的不同变化与细胞生理、发育调控以及疾病的发生密切相关,在特定的环境下发生特定的选择性剪接可能是某些疾病的分子信号,也可能是导致某些疾病的原因。然而,NLRP3炎性体基因转录剪接体在原发性痛风不同中医证型患者发病机制中的作用尚不清楚,故本研究拟以此为切入点,研究NLRP3炎性体基因转录剪接体在原发性痛风不同中医证型患者发病机制中的作用。方法(1)： 用半定量聚合酶链反应(RT-PCR)和／或实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测96例原发性痛风(PG)患者[急性期组44例(APPG)、非急性期组52例(NAPPG)]和30名健康对照(HC)外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3炎性体基因转录剪接体mRNA表达水平。用Western blot检测PG患者和HC PBMCs中NLRP3、PYCARD、 CASP1、NF-κB(p50)蛋白表达水平,用ELISA检测PG患者和HC血.浆中IL-1β、IL-2、 TNF-α的蛋白表达水平,采用免疫比浊法测定血浆CRP水平。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用最小显著差数法(LSD),表达量组间分析采用t检验或秩变换分析进行检验。方法(2)： 收集12例APPG与13例NAPPG患者及8名HC外周静脉血,分别以MSU(50μg/mL)、内毒素脂多糖(LPS)(0.2μg/mL)、MSU(50μg/mL)+LPS(0.2μg/mL)进行刺激培养,分别于培养6h、12h、24h后分离血浆并提取PBMCs,用RT-PCR和／或qRT-PCR法检测各组刺激前后NLRP3炎性体基因转录剪接体mRNA表达水平,用Western blot检测各组刺激前后PBMCs中NLRP3、PYCARD、CASP1、NF-κB(p50)蛋白表达水平,用ELISA检测各组刺激前后血浆IL-1β蛋白表达水平,统计方法同前。方法(3)： 检测44例APPG、52例NAPPG和30名HC白细胞计数(WBC)、嗜中性粒细胞绝对值(GR)、淋巴细胞绝对值(LY)、单核细胞绝对值(MO)、丙氨酸氨基移换酶(ALT)、门冬氨酸氨基移换酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、尿素(Ur)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、载脂蛋白B100(apoB100)、载脂蛋白A1(apoA1),比较上述指标的差异并分析其与NLRP3炎性体基因转录剪接体mRNA表达的相关性,多组间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),各组间两两比较采用最小显著差数法(LSD),表达量组间分析采用t检验或秩变换分析进行检验,变量间的相关性采用Spearman相关性分析。方法(4)： 收集3例APPG与3例NAPPG患者及4名HC外周静脉血,分别以小檗碱(BBR) 5μg/mL与10μg/mL进行刺激培养,分别于培养6h、12h后分离血.浆并提取PBMCs,用qRT-PCR法检测各组刺激前后NLRP3炎性体基因转录剪接体mRNA表达水平,用ELISA检测各组刺激前后血浆CASP1蛋白表达水平,统计方法同前。结果(1)：PG急性与非急性期组以及湿热瘀阻证(ODHS)、痰瘀互结证(IPSBS)、脾虚湿困证(PDIDS)、气血亏虚证(QBDS)各组NLRP3炎性体基因及其部分转录剪接体mRNA表达与HC组比较均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；PG不同期与不同中医证型各组患者NLRP3、PYCARD、CASP1、NF-KB(p50)蛋白表达与HC组比较也均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；PG不同期与不同中医证型各组患者血浆IL-1β、IL-2、 TNF-α、CRP蛋白表达与HC组比较也均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；且各组间相比较也具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。结果(2)： 经MSU、LPS、MSU+LPS刺激后,PG不同期与不同中医证型各组NLRP3炎性体基因及其部分转录剪接体]mRNA表达与HC及刺激前对照组(CG)比较均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；刺激后PG不同期与不同中医证型各组患者NLRP3炎性体及NF-κB(p50)蛋白表达与HC及CG组比较也均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；刺激后PG不同期与不同中医证型各组患者血浆IL-1β蛋白表达与HC及CG组比较也均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；且各组间相比较也具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。结果(3)： 临床实验指标检测结果显示：APPG与NAPPG组部分血常规、肝肾功能、血脂指标与HC组比较均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；相关性分析显示APPG组NLRP3炎性体部分基因及其转录剪接体mRNA表达与其部分临床实验指标具有相关性(P<0.05),且APPG组NLRP3炎性体部分基因及其转录剪接体mRNA表达与PBMCs的IL-1β mRNA及血浆IL-1β蛋白表达均具有相关性(P<0.05),而NAPPG与HC组NLRP3炎性体基因及其转录剪接体mRNA表达与其临床实验指标及IL-1β mRNA、IL-1β蛋白表达均未见相关性(P>0.05)。结果(4)： 经BBR 5μg/mL与10μg/mL刺激后,PG不同期组NLRP3、PYCARD、 CASP1、NLRP3-4、PYCARD-1 mRNA表达与刺激前对照组(CG)比较均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)；刺激后PG不同期组痛风患者血浆CASP1蛋白表达与CG组比较也均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。结论： 在PG不同期与不同中医证型患者的炎症反应中,NLRP3炎性体基因转录剪接体可能发挥重要的作用；MSU对NLRP3炎性体部分基因及其转录剪接体mRNA表达具有一定的调控作用,其可能为MSU诱导PG发生发展的重要环节；PG不同中医证型的变化可能与MSU调控NLRP3炎性体部分基因及其转录剪接体mRNA表达相关；小檗碱对痛风患者表达异常的NLRP3炎性体及其部分基因转录剪接体具有重要的调节作用。