论文部分内容阅读
研究背景及目的心肌缺血性疾病以其高发病率、高死亡率,严重威胁人类的生命健康。现代医学的药物及手术治疗对心肌缺血性疾病有显著的疗效,但这些治疗方法仍然存在很多不足之处。针刺治疗是一种安、验、便、廉的治疗方法,在治疗心肌缺血性疾病中起重要的辅助治疗作用。已有大量的临床研究证实,在血运重建和药物治疗的基础上,进行针刺治疗,能够降低心绞痛的发作频率,降低患者的死亡率,改善患者的生活质量。心脏在交感神经和副交感神经的平衡调节下发挥正常的生理功能,β1-肾上腺素能受体(β1AR)和毒蕈碱M2受体(M2AChR)分别是存在于心肌细胞的交感和副交感神经递质受体的主要亚型,而心脏自主神经功能失衡以及其受体表达和功能活性的异常改变在心脏病理改变中起重要的作用。已有大量的研究证实,针刺内关穴能够调节心脏自主神经的兴奋性,对心肌缺血发挥良好的保护效应。而目前对β1AR和M2AchR及其信号转导通路在针刺保护心肌缺血效应机制中的作用尚缺乏系统性的研究。本研究采用无负重力竭游泳(ES)的方式制备急性心肌缺血(MI)模型,以心电图、血清cTnT、组织学改变为指标,观察电针内关穴改善力竭游泳诱发心肌缺血性损伤的效应。并引入特异性β1AR和M2AchR基因敲除(β1AR-/-和M2AchR-/-)小鼠,采用心脏电生理学技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白印迹法(Western Blot)等技术,检测电针内关穴对β1AR和M2AchR及其受体后信号成分的表达及功能的影响,系统地探讨β1AR和M2AchR及其信号转导通路的变化规律和响应模式。研究方法实验采用C57BL6雄性小鼠42只,β1R-/-和M2AChR-/-雄性小鼠各12只,体重为18-25g。其中18只C57BL6小鼠随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=6)、内关组(n=6),模型组和内关组分别于实验的第1、3、5、7天进行力竭游泳,模型组不进行其他干预,内关组每日电针内关穴30min,正常对照组不进行力竭游泳和电针,仅每日进行抓握固定30min。正常对照组记录基础、第一天和第七天的心电图(ECG),模型组和内关组记录基础ECG,并在第一天和第七天力竭游泳后即刻检测ECG。各组小鼠均于实验结束后处死迅速取心脏,储存于-80℃冰箱以备检测。采用ELISA检测心肌组织中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)的含量,用Western Blot法检测心肌组织中β1AR、M2AchR、兴奋性G蛋白(Gs蛋白)和抑制性G蛋白(Gi蛋白)的表达水平。β1R-/-和M2AChR-/-小鼠均分为模型组(n=6)和内关组(n=6),采用与C57BL6小鼠相同的干预方案,检测基础ECG及实验第1天和第7天力竭游泳后的即刻ECG。另外24只C57BL6小鼠,随机分为正常对照组(n=8)、模型组(n=8)、内关组(n=8),采用上述相同的干预方法,正常对照组在实验第7天麻醉后取心脏,模型组和内关组均于第7天力竭游泳后即刻麻醉取心脏。将每组中4只小鼠的心脏置于Langendorff灌流装置,分离心肌细胞,分别检测单个心肌细胞在多巴酚丁胺(β1AR激动剂)、Forskolin (腺苷酸环化酶激动剂)、8-Br-cAMP (cAMP的拟似剂)、乙酰甲胆碱(MCh,M2AchR激动剂)和8-Br-cGMP (cGMP的拟似剂)作用下钙瞬变波幅的变化,观察心肌细胞中β1AR、M2AchR的反应性,腺苷酸环化酶(AC)、蛋白激酶A(PKA)和磷酸二酯酶(PDE)的活性变化;并收集血液,以备检测血清中cTnT的含量。每组中另外4只小鼠取心脏置于4%多聚甲醛固定,以备组织学检测。研究结果(1)力竭游泳能够使C57BL6小鼠心电图J点发生显著偏移(模型组P<0.05,内关组P<0.01,与正常对照组比较),心率显著降低(模型P<0.05,内关组P<0.05,与同组基础心率比较);血清cTnT含量显著升高(P<0.05);组织学检测显示左心室心肌组织存在明显的缺血区域,并呈现典型的心肌缺血病理改变。电针内关穴后,可以显著减小心电图J点的偏移量(P<0.01,与同组第1天比较;P<0.05,与模型组第7天比较),降低血清中cTnT的含量(P<0.01),组织学检测显示心肌缺血病理改变明显改善,缺血区域明显减小(P<0.01),缺血程度明显减轻(P<0.01)。但是,电针对力竭游泳所致的心率减慢没有明显的影响,内关组心率仍显著低于基础心率(P<0.05)。(2) β1AR和M2AchR敲除后,电针内关穴改善心肌缺血的效应消失。(3) β1AR信号转导通路在电针保护心肌缺血性损伤中的作用:力竭游泳后,心肌组织中β1AR的表达显著降低(P<0.01),其对多巴酚丁胺的反应性较正常对照组显著降低(P<0.05)。心肌组织中Gs蛋白的表达没有明显改变,cAMP的含量显著降低(P<0.01)。单个心肌细胞对Forskolin的反应性与正常对照组比较没有明显的改变,而在8-Br-cAMP的作用下心肌细胞钙瞬变的幅值显著降低(P<0.05)。.电针内关穴后,心肌组织中β1AR的表达量较模型组显著增加(P<0.05),心肌细胞对多巴酚丁胺的反应性显著增强(P<0.05)。心肌组织中Gs蛋白和cAMP的含量与模型组比较没有显著变化(P>0.05)。单个心肌细胞在Forskolin的作用下,其钙瞬变的幅值较模型组显著降低(P<0.05),心肌细胞在8-Br-cAMP激动下的钙瞬变波幅与模型组比较没有显著改变(P>0.05)。(4) M2AchR信号转导通路在电针保护心肌缺血性损伤中的作用:力竭游泳后,心肌组织中M2AchR的表达显著减低(P<0.01),心肌组织中Gi蛋白的表达较正常对照组没有明显改变,cGMP的含量显著降低(P<0.01)。单个心肌细胞内钙瞬变波形的幅值在乙酰甲胆碱(P<0.01)和8-Br-cGMP (P<0.01)的作用下较正常对照组显著增加。电针内关穴后,心肌组织中M2AchR的表达显著增加(P<0.01), Gi蛋白的表达有上调的趋势,而cGMP的含量与模型组比较没有明显变化(P>0.05)。单个心肌细胞内钙瞬变波形的幅值在乙酰甲胆碱(P<0.01)和8-Br-cGMP (P<0.05)的作用下较模型组均显著降低。结论本实验结果提示,电针内关穴能够减轻力竭运动所致的心肌缺血性损伤,β1AR和M2AChR共同参与介导了该效应。电针内关穴能够提高力竭游泳小鼠心肌组织中β1AR的表达水平,并提高β1AR的敏感性。同时,电针内关穴也能够增加力竭游泳小鼠心肌组织中M2AChR的表达,通过增加M2AChR-Gi蛋白的兴奋性,抑制AC的活性,抑制下游cAMP依赖性反应,以保持β1AR信号通路的适度兴奋性。而M2AchR下游的cGMP-PDE信号通路可能并未参与介导电针内关穴保护力竭运动所致心肌缺血效应的机制。电针内关穴可能能够使βi-AR和M2AChR信号转导通路恢复正常水平的兴奋性,并维持两者的平衡,从而恢复交感神经和副交感神经的正常调节作用,发挥对力竭运动所致心肌缺血的保护效应。