论文部分内容阅读
目的：应用siRNA干扰口腔鳞癌Tac8113细胞株内NF-κBp65基因的表达,同时联合应用化疗药物5-Fu,观察NF-κBp65 siRNA对口腔鳞癌Tac8113细胞株增殖、凋亡和耐药的影响,拟为口腔鳞癌的靶向治疗提供新思路。方法：体外培养Tac8113细胞,并分为三组：①空白对照组；②阴性对照组；③实验组。1. 构建NF-κBp65 siRNA,瞬时转染口腔鳞癌Tac8113细胞,应用荧光显微镜观察Tac8113细胞的转染情况,并计算细胞转染率；2. 应用半定量RT-PCR法检测转染后对Tac8113细胞内NF-κBp65 mRNA表达水平的影响；3. 应用ELISA法检测转染对Tac8113细胞内NF-κBp65蛋白表达水平的影响；4. 应用MTT法检测转染后对Tac8113细胞增殖的影响；5. 应用流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI法)检测转染后对Tac8113细胞凋亡的影响；6. 转染后将细胞分为未转染组(空白对照组)和转染组,联合应用不同浓度的化疗药物5-Fu(0mg/L、16.35 mg/L、32.7 mg/L、327 mg/L、3270 mg/L、6540 mg/L),培养48h,观察转染后Tac8113细胞对化疗药物5-Fu敏感性的影响。结果：1. 应用荧光标记的NF-κBp65 siRNA转染Tac8113细胞,转染后24h,荧光显微镜观察发现多数实验组细胞胞核内有绿色荧光信号存在,细胞转染率约为61%；2.半定量 RT-PCR检测结果显示,转染后48h,空白对照组、阴性对照组、实验组细胞内NF-κBp65 mRNA的相对表达量分别为0.539±0.036、0.514±0.031、0.313±0.031,实验组细胞内NF-κBp65 mRNA的相对表达量与空白对照组和阴性对照组相比明显减少,差异具有统计学 意义(P<0.05)；3. ELISA检测结果显示,转染后48h,空白对照组、阴性对照组、实验组Tca8113细胞内NF-κBp65蛋白的相对表达量分别为1.165±0.074、1.182±0.049、1.002±0.055(ng/ml),与空白对照组和阴性对照组相比实验组细胞内NF-κBp65 蛋白的相对表达量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)；4. MTT检测结果显示,在各时间段内实验组Tac8113细胞生长缓慢,实验组细胞的增殖活性与空白对照组和阴性对照组的比较明显降低,细胞增殖明显受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且在转染后第72h抑制作用最大,细胞抑制率达到28.1%； 5.流式细胞仪检测结果显示,转染后72h ,三组细胞的细胞凋亡率分别为(8.50±0.92)%、(8.39±1.03)%、(24.58±2.31)%,实验组细胞的凋亡率要明显高于两个对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且实验组细胞的早期凋亡率升高幅度要大于晚期凋亡率；6. 转染后联合应用不同浓度的5-Fu , MTT检测结果显示,转染后72h,未转染组和转染组细胞的增殖活性随着浓度的升高都有下降趋势,但同一浓度内转染组细胞的增殖活性下降得要比未转染组细胞更加明显,差异具有统计学意义(P<0.05),即转染后Tca8113细胞对化疗药物5-Fu的敏感性明显升高。结论：1.NF-κBp65 siRNA可有效地转染口腔鳞癌Tac8113细胞。2. 转染后NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达量明显减少,结果提示NF-κBp65 siRNA沉默了Tac8113细胞内NF-κBp65基因的表达。3. 沉默NF-κBp65 基因可抑制Tac8113细胞的生长增殖,并且可诱导Tac8113细胞的凋亡。4. 沉默NF-κBp65基因后,Tac8113细胞对化疗药物5-Fu的敏感性得到了提高。5. 沉默NF-κBp65基因可作为口腔鳞癌基因治疗的潜在靶点。