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研究背景与目的:穿山龙为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎,性温,味甘、苦。主产于辽宁、吉林、黑龙江、河北、陕西等地,其主要有效成分为甾体皂苷类化合物,另含有多糖类、淀粉、氨基酸和黄酮等成分,具有调节免疫、降糖、改善心血管功能、保肝、抗肿瘤、抗炎等药理作用,是合成甾体激素类药物和抗心脑血管疾病皂苷类药物的基本医药化工原料,可用于治疗风湿性关节炎、心脑血管等疾病,在中医临床和甾体药物工业中占有重要的地位,具有重大的应用价值和广阔的市场潜力。本文旨在研究穿山龙药材质量,构建穿山龙指纹图谱,形成穿山龙药材产地加工方法的标准,提高药材品质。进一步阐释穿山龙主要成分薯蓣皂苷抗脑缺血再灌注损伤保护机制,为穿山龙进一步开发提供理论依据。方法:本文首先以药典为标准考察了穿山龙药材基本质量,并采用HPLC建立穿山龙药材指纹图谱并对其进行化学计量学分析,运用聚类分析与主因素分析推算可作为穿山龙质量标准物质,进一步采用HPLC测定作为穿山龙质量标准物质含量,提升穿山龙质量标准。采用HPLC建立同时测定原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂、伪原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷含量测定方法。对传统阴干、冷冻干燥、蒸制阴干及不同温度快速烘干加工方式的穿山龙药材外观性状上和5种皂苷进行了测定和比较。使用虚拟筛选技术对穿山龙主要物质薯蓣皂苷作为补体进行反向虚拟筛选,利用分子对接筛选受体蛋白,并对筛选结果进行打分,筛选出与脑缺血再灌注相关蛋白。在薯蓣皂苷抗氧糖剥夺/复氧损伤研究中,选取化学缺氧诱导剂氯化钴（CoCl2）作为PC12细胞缺氧诱导剂,采用CCK-8法测定CoCl2建立OGD/R模型最佳条件和薯蓣皂苷对PC12细胞OGD/R模型的保护作用,测定细胞上清液中LDH水平。进一步利用荧光定量PCR及Western blot检测薯蓣皂苷对OGD/R损伤保护机制研究。结果:1.不同产地的34批穿山龙药材均符合药典水分<12%、灰分<5%、浸出物>20%以及薯蓣皂苷含量均>1.3%标准;在建立了穿山龙的高效液相指纹图谱,结果导入软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）,标注13个共有峰,其共有峰相对保留时间RSD为0.101.60%,共有峰相对峰面积RSD为28.5789.18%;进行相似度分析及聚类分析,聚类分析和相似度分析结果显示穿山龙指纹图谱可靠;主成分分析综合得分结果、相关性分析以及特征值、方差贡献率验证原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷可做为新的质量标准指标;使用HPLC建立了同时测定上述5种皂苷的色谱方法,测得其含量范围分别在7.9033.38mg/g、1.4311.04 mg/g、2.3212.05mg/g、0.21121.8124mg/g、4.81511.96mg/g之间,其中位数为25.93、7.10、8.70、0.55、9.21mg/g,暂定其含量限度范围不低25.00、7.00、8.00、0.50、9.00mg/g;2.不同炮制方法的样品测定分析结果表明,穿山龙5种皂苷含量存在差异,冷冻干燥为保留穿山龙饮片中5种皂苷最佳炮制加工方法,提高原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷的含量,而原纤细薯蓣皂苷含量无明显差异;蒸制阴干下原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及伪原薯蓣皂苷含量最高,薯蓣皂苷含量为0.71 mg/g,远远低于含量第二低的70℃快速干燥7.96mg/g;鼓风快速干燥下,原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷随温度升高含量降低,伪原薯蓣皂苷含量变化相反;3.虚拟筛选结果显示,薯蓣皂苷与HetR、Genome polyprotein、Beta-elicitin cinnamomin、Cold shock domain-containing protein E1、Glutaryl-CoA dehydrogenase,mitochondrial等蛋白结合率较高,筛选结果与薯蓣皂苷药理作用的报道基本一致;Citde2可作为薯蓣皂苷潜在药用靶点之一,相关文章提示其作用机制原理可能与自噬相关。4.在抗氧糖剥夺/复氧损伤的实验中:绘制细胞标准曲线,CCK-8对PC12细胞最佳反应细胞数为1.6×105个细胞,反应1h;采用不同浓度Cocl2低糖DMEM培养基培养24 h、48 h及72 h,结果为400μM Cocl2低糖DMEM培养24h为最佳OGD/R造模条件;细胞毒性研究结果显示,400μM Cocl2低糖DMEM培养24h为最佳OGD/R造模条件,薯蓣皂苷给药量不高于400 ng/mL下无明显细胞毒性,尼莫地平给药量为1600 ng/mL以下无明显毒性;检测LDH水平实验结果显示,薯蓣皂苷与尼莫地平能有效的减低Cocl2引起LDH升高;荧光定量PCR结果显示,薯蓣皂苷能有效的使Cited2 mRNA表达降低,负反馈调节FoxO3 mRNA表达升高,同时引起Cited2下游Nix和LC3 mRNA表达降低;Western blot结果显示,薯蓣皂苷抑制Cited2表达,同时Cited2表达降低引起Nix表达水平下降,从而LC3-Ⅱ表达下降,抑制氧糖剥夺复氧复糖诱导的自噬。结论:1.构建穿山龙药材指纹图谱以及同时测定多成分色谱方法,结合化学计量分析,结果显示原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷可共同构建穿山龙药材质量新标准。2.对传统阴干、冷冻干燥、蒸制阴干及不同温度快速烘干加工方式的穿山龙药材外观性状上和5种皂苷进行了测定和比较。结果表明冷冻干燥为保留穿山龙饮片中5种皂苷最优炮制加工方法。3.对薯蓣皂苷进行计算机反向虚拟筛选,结果显示:Citde2可作为薯蓣皂苷潜在药用靶点之一,相关文章报道其作用机制原理可能与自噬相关。4.薯蓣皂苷抑制Cited2表达,负反馈调节FoxO3表达升高,同时因Cited2表达抑制,其下游Nix和LC3表达减少,从而抑制自噬保护细胞。