B7-1(又称CD80)分子为约50KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,基因定位于3q21,是首个被研究发现的B7家族成员。该分子主要表达于抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC)表面,其与表达于T细胞的相应受体分子CD28/CTLA-4结合,提供T细胞活化、增殖及分化所需的共刺激信号,从而介导免疫应答。近年来的研究发现,B7-1分子也表达于某些肿瘤细胞,如B淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞等,且该分子转导的信号可能参与了肿瘤细胞的恶性生长、免疫逃逸及转移扩散等。因此,通过特异性抗体或基因沉默可封闭或抑制B7-1分子在相关肿瘤的表达,进而发挥潜在的抗瘤效应。本课题先行运用B淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠抗人B7-1单克隆抗体(Monoclonal Antibody,mAb),在对其抗体类型、特异性、效价及识别的细胞膜型分子等生物学特性鉴定的基础上,以多株高表达B7-1分子的B系恶性肿瘤细胞株Daudi、Raji及8266作为观察对象,先后采用单抗封闭该肿瘤细胞表面B7-1分子或RNAi技术沉默B7-1的表达后,通过MTT和Transwell?实验对B系肿瘤细胞的增殖和迁移等生物学行为进行了系统的观察和分析。旨在探究和寻找此类肿瘤的新靶点分子及抗瘤手段。第一部分鼠抗人B7-1 mAb的制备及生物学特性鉴定目的:制备鼠抗人B7-1mAb同时鉴定其生物学特性。方法:采用L929-B7-1细胞作为免疫原,多次免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术进行细胞融合,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)筛选分泌鼠抗人B7-1mAb的杂交瘤细胞株继续克隆化培养,小鼠体内腹水诱生法制备抗体,进一步protein A免疫亲和层析法纯化并SDS聚丙乙烯酰胺凝胶电泳法测其纯度;抗体亚型定性试纸法鉴定该mAb类型;FCM检测抗体效价及竞争结合位点。结果:经多次杂交和筛选获得一株稳定分泌鼠抗人B7-1mAb的杂交瘤细胞株,命名5G10,其分泌的抗体重链为IgG1,轻链均为κ链。抗体纯化后得率为1.62mg/mL腹水,并测得抗体纯度为96%;抗体效价为用于间接免疫荧光分析时,106个细胞的最低用量为0.1μg,且与商品化抗体(克隆号:2E1)识别不同的抗原表位。结论:本研究成功制备出特异性的鼠抗人B7-1mAb,且该抗体具有良好的生物学活性。第二部分单抗5G10对表达B7-1分子的肿瘤细胞株膜型分子的识别及体外增殖迁移的影响目的:以表达B7-1分子的B系肿瘤细胞株为研究对象,进一步分析单抗5G10对该细胞株增殖和迁移的影响。方法:采用间接免疫荧光法筛选高表达B7-1分子的B淋巴瘤细胞株Daudi、Raji及多发性骨髓瘤细胞株8266,加入不同终浓度的B7-1mAb共同孵育48h,采用MTT法分析该肿瘤细胞增殖的情况;在此基础上,应用TranswellTM法分析了肿瘤细胞与B7-1mAb共同孵育后迁移能力的变化。结果:B系肿瘤细胞株Daudi、Raji及8266细胞的膜型B7-1分子的表达阳性率分别(96.3±2.12)%、(95.7±1.79)%及(96.8±2.48)%。MTT结果显示:抗体终浓度在 20μg/mL 时,5G10mAb对 Daudi、Raji 及 8266 细胞增殖的抑制率分别为(22.50±1.04)%、(12.70±1.43)%及(11.41 士0.84)%,与同型对照组(3.91±0.53)%、(2.40±0.22)%及(1.15±0.24)%相比,差异有统计学意义(P<0.05)。TranswellTM结果显示:5G10mAb在上述终浓度时,Daudi、Raji 及 8266 细胞的迁移率分别为(22.19±1.19)%、(22.47士2.58)%及(21.32±1.93)%,明显低于同型 IgG 组(25.31±1.17)%、(27.25士0.42)%及(23.95±1.48)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5G10单抗能够特异性的识别Daudi、Raji及8266肿瘤细胞膜型B7-1分子,并且通过封闭B7-1分子抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,提示B7-1分子介导的信号可能参与了该肿瘤细胞的生物学行为,同时也表明该鼠抗人B7-1单抗具有抑瘤效应。第三部分RNAi沉默B7-1对肿瘤细胞生物学行为的影响目的:应用RNAi技术沉默B系肿瘤细胞株Daudi、Raji及8266细胞B7-1分子的表达,再行观察其增殖和迁移的变化,旨在探究B7-1分子在相关肿瘤细胞增殖及迁移中的作用。方法:设计3条siRNA核苷酸序列后,委托吉玛公司进行病毒的包装和生产。获得用于感染目的细胞的病毒液后,将其以十倍稀释4个梯度并感染状态良好的293T细胞,使用荧光显微镜测定慢病毒的滴度。进一步用不同浓度的病毒稀释液分别感染Daudi、Raji及8266肿瘤细胞,运用FCM检测慢病毒对肿瘤细胞的感染效率,并经Western Blot检测慢病毒对肿瘤细胞B7-1分子的沉默效率。选择感染效率相对较高及沉默效果较好的慢病毒为研究工具,分别感染Daudi、Raji及8266细胞,先后采用MTT法和TranswellTM法分析上述肿瘤细胞增殖和迁移的变化情况。结果:本研究获取的3株重组慢病毒根据其序列位点分别命名为LV-471、LV-659及LV-997,其滴度均为1×109TU/mL。FCM结果表明,细胞中绿色荧光蛋白的表达量随着病毒浓度的增加相应升高,感染效果最佳的的病毒浓度为1×108TU/mL。其中对上述细胞感染效果最较好的慢病毒为LV-997,其感染效率依次为89.6%、71.9%及87.1%。进一步分析发现,经3株不同的慢病毒感染后,Daudi、Raji及8266细胞表面的B7-1分子的平均荧光强度(mean值)均下降,LV-997的干扰效果相对较好,经该病毒感染上述肿瘤细胞表面B7-1分子的荧光强度mean值依次降低了 71.4%、42.5%及53.5%。同时Western Blot结果也表明对肿瘤细胞B7-1分子沉默效果较好的慢病毒为LV-997。经感染效率较佳沉默效果较好的慢病毒LV-997感染Daudi、Raji及8266细胞后72h,MTT法检测结果显示,LV-997病毒感染该肿瘤细胞对其增殖的抑制率分别为(17.65±2.04)%、(20.48±1.19)%及(24.4±2.14)%,与阴性对照组(2.03±0.27)%、(1.18±0.36)%及(3.75±0.52)%相比,有统计学意义(P<0.05);TranswellTM 法结果表明,LV-997病毒感染Daudi、Raji及8266细胞的迁移率分别为(20.15±1.86)%、(28.73±2.17)%及(12.29±1.38)%,明显低于同型 IgG 组(23.81±1.74)%、(32.25±0.95)%及(18.35±1.91)%,有统计学意义(P<0.05)。结论:成功筛选出一株高感染效率及良好沉默效果的慢病毒LV-997,其在基因水平上通过下调B7-1分子在Daudi、Raji及8266细胞的表达后显著抑制其增殖及迁移。提示B7-1不仅参与部分B系肿瘤的生物学功能,而且可能成为表达B7-1分子的B系肿瘤免疫治疗的潜在靶点。