【摘 要】
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目的:应用高通量芯片技术建立胎儿生长受限（FGR）胎盘环状RNA表达谱,筛选出2个在FGR中显著差异表达、功能未知的环状RNA,circ-0081343和circ-0000848,分析其与FGR的相关性,拟从circRNA这个新视角阐明FGR的发病机制,为胎儿生长受限的早期诊断及病理机制提供新的生物学标志物/。方法:1.对3例FGR胎盘组织和3例正常对照胎盘组织进行环状RNA芯片检测,立胎儿生长受
【基金项目】
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2017年深圳市科创委基础研究学科布局课题JCYJ20170413092818116,胎盘组织基因组拷贝数变异与胎儿宫内生长发育迟缓的关联研究；
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目的:应用高通量芯片技术建立胎儿生长受限（FGR）胎盘环状RNA表达谱,筛选出2个在FGR中显著差异表达、功能未知的环状RNA,circ-0081343和circ-0000848,分析其与FGR的相关性,拟从circRNA这个新视角阐明FGR的发病机制,为胎儿生长受限的早期诊断及病理机制提供新的生物学标志物/。方法:1.对3例FGR胎盘组织和3例正常对照胎盘组织进行环状RNA芯片检测,立胎儿生长受限胎盘环状RNA表达谱。在37例FGR胎盘组织和37例对照胎盘组织中,验证差异表达的环状RNA,选择差异表达较大的circ-00813433和circ-0000848为候补环状RNA。2.通过构建过表达和抑制circ-0081343和c i rc-0000848的细胞模型,进行transwell迁移侵袭实验和细胞凋亡流式分析,研究其在FGR中的分子生物学功能。并通过qRT-PCR和western blot,检测HTR-8细胞中相关下游基因的表达水平。3.对circ-0081343和circ-0000848进行生物倍息学分析,预测与其结合的mi RNA及其结合位点以及寻找调控的下游靶基因。（1）分别过表达和抑制circ-0081343或circ-0000848,检测IITR-8细胞中的miR-210-5p或miR6768-58p,DLX3基因或BCL2基因的表达水平;并通过RNA荧光原位杂交、RNA免疫沉淀、双荧光素酶报告基因实验来检测相互结合情况。（2）共转染 circ-0081343 质粒和 miR-210-5p 模拟物,共转染 circ-0000848质粒和miR-6768-5p模拟物,通过transwell迁移侵袭实验和细胞凋亡流式分析,观察HTR-8细胞生物学行为的变化;并qRT-PCR和western blot,检测HTR-8细胞中靶基因和相关下游基因的表达水平。结果:1.通过高通量环状RNA芯片检测以及生物信息学分析,筛选出差异表达较大的2条环状RNA:circ-0081343和circ-0000848。在临床组织标本进行验证,发现与正常胎盘组织相比,其在FGR胎盘组织中表达明显下降。2.过表达circ-0081343或circ-0000848后,细胞侵袭迁移能力增加,凋亡减少;抑制circ-0081343或circ-0000848后,细胞侵袭迁移能力降低,凋亡增加。3.经生物信息学分析,挑选miR-210-5p作为circ-0081343的候补miRNA,DLX3 作为 miR-210-5p 的靶基因;挑选 miR-6768-5p 作为 circ-0000848 的候补miRNA,BCL2基因作为miR-6768-5p的靶基因;4.RNA荧光原位杂交、RNA免疫沉淀和双荧光素酶报告基因实验证实circ-0081343 与 miR-210-5p 结合,circ-0000848 与 miR-6768-5p 结合;双荧光素酶报告基因实验证实miR-210-5p可与DLX3基因结合,miR-6768-5p可与BCL2基因结合。5.当circ-0081343表达增强时,miR-210-5p表达下降,DLX3基因表达上升,促进细胞迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡;当circ-0081343表达下降时,miR-210-5p表达增强,DLX3基因表达下降,降低了细胞迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。说明circ-0081343和miR-210-5p两者存在内源性竞争作用,相互调控,影响下游蛋白的表达,从而影响细胞生物学的功能;6.当circ-0000848表达增强时,miR-6768-5p表达下降,BCL2基因表达上升,促进细胞迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡;当circ-0000848表达下降时,miR-6768-5p表达增强,BCL2基因表达下降,降低了细胞迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。说明circ-0000848和miR-6768-5p两者存在内源性竞争作用,相互调控,影响下游蛋白的表达,从而影响细胞生物学的功能;结论:目前关于FGR胎盘组织中环状RNA的表达和调控机制研究尚未见报道。本实验明确环状RNA circ-0081343和circ-0000848在FGR胎盘组织中明显表达下调,说明其表达降低与FGR发病具有相关性。环状RNA circ-0081343和circ-0000848以ceRNA作用形式分别于mi R-210-5p和miR-6768-5p竞争性结合,调控靶基因及相关下游基因的表达,进而促进人胎盘滋养层细胞的迁移侵袭能力,抑制细胞凋亡。
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