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隐孢子虫(Cryptosporidium)、十二指肠贾第虫(Giardia Duodenalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)是常见的人兽共患肠道原虫,具有多种传播途径,在世界范围内广泛流行。大量研究表明家畜是人体隐孢子虫病的主要动物传染源,而牛又被认为影响最大。相对于中国内地,西藏地区养殖业以放牧为主,家畜资源丰富但集约化程度较低,牦牛是西藏地区畜牧业经济和牧民生活中不可缺少的重要畜种,与当地牧民接触频繁。因此对西藏地区牦牛隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫相关的流行病学及进化关系展开研究分析很有必要。本研究对西藏林芝、山南和日喀则三个地区的牦牛进行样品采集,采用分子生物学方法对西藏地区牦牛隐孢子虫虫种、十二指肠贾第虫集聚体类型和毕氏肠微孢子虫基因型进行鉴定,探明西藏地区三种肠道原虫的分布特征,是否和内地其他地区的相同,是否与西藏地区交通不便和病原重组机会少有关系,结合分子流行病学数据对三种肠道原虫的人兽共患风险和进化关系进行分析。 第一部分:西藏地区牦牛肠道寄生虫感染情况调查 采用水洗沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖漂浮法对西藏林芝、山南和日喀则牧区内577份放牧牦牛粪便样品中进行显微镜检查,肠道寄生虫总感染率为82.7%,46.4%的样品混合感染2-5种肠道寄生虫。共发现10种肠道寄生虫,十种肠道寄生虫的感染率分别为球虫45.4%、十二指肠贾第虫0.4%、隐孢子虫1.6%、圆线虫36.6%、鞭虫3.8%、吸虫1.6%、绦虫3.1%、阿米巴原虫53.4%、蛔虫3.6%和结肠小袋纤毛虫1.0%,以阿米巴原虫为优势感染种类。米林县、工布江达县、巴宜区、加查县和谢通门县感染率分别为95.2%、65.6%、85.1%、82.1%和93.1%,感染率统计学差异计学差异极显著(P<0.01)。 第二部分:西藏地区牦牛隐孢子虫分子流行病学研究 基于SSU rRNA基因,577牦牛粪便样品中发现隐孢子虫阳性样品8份,总感染率为1.4%。共发现两种隐孢子虫:安氏隐孢子虫C.andersoni和牛隐孢子虫C.bovis,安氏隐孢子虫感染率最高。不同地点牦牛隐孢子虫感染率为0-6.9%,感染率统计学差异极显著(P<0.01)。谢通门县感染率最高,为6.9%,米林县和加查县未发现隐孢子虫感染,巴宜区和工布江达县感染率均为0.8%。 第三部分:西藏地区牦牛十二指肠贾第虫分子流行病学研究 基于SSU rRNA和tpi基因,577牦牛粪便样品中发现十二指肠贾第虫阳性样品10份,总感染率为1.7%,鉴定结果显示10个分离株均为集聚体E。不同地点牦牛十二指肠贾第虫感染率为0%-3.6%,感染率统计学差异不显著(P>0.05)。加查县感染率最高,为3.6%,米林县未见十二指肠贾第虫感染,谢通门县、巴宜区和工布江达县和感染率分别为1.4%、1.5%和2.4%。 第四部分:西藏地区牦牛毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定 基于ITS基因,577份牦粪便样品中发现毕氏肠微孢子虫阳性样品29份,总感染率为5.0%,不同地点牦牛毕氏肠微孢子虫感染率为1.6%-12.9%,感染率统计学差异显著(0.01<P<0.05)。米林县感染率最高,为12.9%,工布江达县感染率最低,为1.6%,巴宜区、加查县和谢通门县感染率分别为4.9%、5.4%和5.6%。本研究序列校准比对后共发现6种毕氏肠微孢子虫基因型:D(n=5)、I(n=6)、J(n=2)、CHC8(n=1)、BEB4(n=14)和BEB6(n=1),以基因型BEB4感染率最高。种系进化关系显示基因型D位于1群中,为人兽共患群,其余5种基因型BEB4、I、J、CHC8和BEB6同时处于2群,具有一定人兽共患风险。 综上所述,本研究首先对西藏地区牦牛肠道寄生虫进行了常规显微镜检查,然后利用分子生物学方法鉴定了西藏地区牦牛隐孢子虫种类、十二指肠贾第虫集聚体类型和毕氏肠微孢子虫基因型,结合国内外关于三种肠道原虫流行病学的报道及种系进化关系对西藏地区牦牛隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫进行了流行病学研究和人兽共患风险分析。为深入研究隐孢子虫、十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫的流行传播提供了参考。