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灵芝(Ganoderma lucidum(Curtis:Fr.)P.Karst)是我国传统中药中重要的药用真菌,可用于治疗多种疾病。现代研究证明灵芝具有增强免疫力、抑制肿瘤、保肝、抗氧化、延缓衰老、抗病毒、抗炎、降血糖等多种作用。灵芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide, GLP)是灵芝中一种极为重要的生理活性物质,近年来受到越来越多的关注。研究发现多糖的生物活性与其结构关系密切,对多糖进行结构修饰,是改变多糖性质和生物活性的重要手段。本论文旨在对从灵芝子实体中分离纯化的多糖进行硫酸化修饰,研究硫酸化对多糖生物活性影响,以期获得新的活性灵芝多糖材料。研究结果对了解灵芝多糖的硫酸化对其生物活性变化规律,探索扩大灵芝多糖的应用范围,都具有非常重要的学术价值和现实意义。本论文主要分为三个部分,分别为灵芝子实体多糖的分离纯化、灵芝子实体多糖的硫酸化修饰和灵芝子实体多糖及其衍生物生物活性研究。主要研究结果如下：1.灵芝子实体多糖的分离纯化1.1灵芝多糖的不同组份的制备和分离纯化灵芝子实体利用不同的制备方法共获得17个不同的组份或均一多糖。利用热水提取、超滤方法得到了不同分子量段的多糖组份G1,G2,G3,对G3利用醇沉的方法获得了G3-1和G3-2组份；利用碱提的方法得到碱提水溶多糖组份A1,A2和碱溶水不溶的多糖组份A3；利用离子交换层析得到组份LZ1,LZ2,LZ4,LZ5和LZ6,利用大孔树脂脱色、亲和层析和凝胶层析方法得到了组份LZ5-W,LZ5-S,LZ5-W-2和LZ5-W-2-A.经HPLC鉴定LZ5-S和LZ5-W-2-A为均一多糖,其分子量分别为1.35x104Da,4.09x104Da。LZ5-W-2-A为白色絮状样品,LZ5-S为淡黄色絮状样品,均易溶于水,甲酰胺。利用高效阴离子色谱测得LZ5-S多糖主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和糖醛酸组成,其摩尔比约为2：4：1：2,并含有少量阿拉伯糖、木糖；多糖LZ5-W-2-A主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和糖醛酸组成,其摩尔比约为2：2：1：1。1.2利用ConA-Sepharose4B亲和层析对组份LZ5-W的纯化利用ConA-Sepharose4B对LZ5-W进行纯化,首先考察了竞争性洗脱剂的最佳浓度,发现洗脱剂甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的浓度为0.05M较为合适。进一步研究LZ5-W在填料上的载量,发现其在ConA-Sepharose4B的载量大于20mg/mL。利用亲和层析从LZ5-W中纯化出多糖LZ5-W-2,其单糖组成中甘露糖的比例提高了37.2%。1.3利用大孔树脂对灵芝多糖脱色由于在预试验中发现,灵芝各组分的颜色对进一步的硫酸化样品中硫酸基的测定有严重的影响,因此本论文研究了灵芝多糖的脱色工艺。用脱色1号、D303、D315、HZ806这四种大孔树脂对灵芝多糖G3的脱色,发现脱色1号效果最佳,最佳上样浓度为2-3mg/mL。在最佳脱色浓度下,脱色率可达93.62%,且样品的糖含量基本保持不变,蛋白含量明显降低。利用获得的脱色条件对G1、G2、G3-1、G3-2、LZ5、A1、 A2进行了处理,为样品的硫酸化了提供合适原料。2.灵芝子实体多糖的硫酸化修饰单因素试验表明氯磺酸和吡啶的比例、反应温度、反应时间对多糖硫酸化有影响。以取代度或得率为评价指标,对不同分子量大小的样品的硫酸化进行了三因素三水平的正交实验,结果发现以取代度为指标各因素对多糖硫酸酯化的影响顺序为：氯磺酸和吡啶的比例>反应温度>反应时间,最佳组合为B2A2C3,即最佳反应条件为氯磺酸和吡啶的体积比为1：8,反应温度80℃,反应时间3h；以得率为指标,反映条件对多糖硫酸化的影响顺序是：反应温度>氯磺酸和吡啶的比例>反应时间,最佳组合为A1B3C3,即最佳反应条件为反应温度60℃,氯磺酸和吡啶的体积比为1：10,反应时间3h。用取代度为指标获得的最佳反应条件下对不同的灵芝多糖组份进行硫酸化,得到了44种硫酸化的灵芝多糖,产物的最高取代度可达0.66,不同的样品得率差异比较大,其范围是40%-83.2%。硫酸基团的加入明显的提高了碱提水不溶的样品A3的溶解性,使其由不溶于水的样品变成了可溶于水的样品。3.灵芝子实体多糖及其衍生物的生物活性研究以刺激免疫、抗凝血、抗肿瘤、抗菌四个指标考察了灵芝子实体多糖及其衍生物的生物活性。3.1免疫活性利用体外刺激RAW264.7巨噬细胞株产生NO的试验考察灵芝多糖及其硫酸化产物的免疫活性,结果发现各组分灵芝多糖硫酸化产物均有刺激巨噬细胞产生NO的作用,且活性高于其前体物质,并存在浓度依赖性。之后通过刺激小鼠脾淋巴细增殖试验考察不同取代度的硫酸化产物的免疫活性,结果发现G1的活性表现为低取代度产物>前体>高取代度产物,G2的活性表现高取代度产物>前体>低取代度产物,G3-2的活性表现为低取代度产物>前体>高取代度产物。纯度较高的样品LZ5-S有明显的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的作用,但其硫酸化的产物LZ5-S-S2该活性降低。碱提水不溶的组份A3无明显的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖和刺激巨噬细胞株产生NO的作用,但其硫酸化产物A3-S的这两种免疫活性明显。3.2抗凝血活性灵芝水提物各组分本身均没有显著的抗凝血作用,但硫酸化之后的产物在终浓度1.25mg/mL时均具有抗凝血的作用,组份A1和A2及G2其硫酸化产物均具有很好的抗凝血效果,碱提水不溶的组份A3无抗凝血作用,而其硫酸化产物A3-S却拥有了较好的抗凝血作用。G1硫酸化产物的抗凝血作用随着取代度的增加而增强,G2的硫酸化产物无论取代度高低其抗凝血的活性均远高于阳性对照肝素。各样品及其硫酸化产物均在APPT上有抗凝效果,但是对PT和TT的作用不明显,所以其抗凝血作用主要是通过影响内源凝血途径而发挥作用的。3.3抑制肿瘤细胞增殖灵芝多糖不同分子量段的组份G1、G2、G3表现出十分弱的抗肿瘤作用,其中G1、G2、G3的硫酸化产物较其前体物质抗肿瘤作用略有提高。离子柱层析获得的各组分LZ2和LZ4基本无抗肿瘤作用,硫酸化之后抗肿瘤作用也无明显提高。硫酸化产物LZ5-S抗肿瘤作用较其LZ5略有增加。3.4抗菌活性浓度为5mg/mL时,各样品对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均无明显体外抑制作用。