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研究目的：1.通过立体定向技术将6-OHDA直接注射到前脑内侧束来建立一种简单、有效的PD大鼠模型,为下一步研究奠定基础。2.建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、扩增方法。3.判断重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-NOGGIN对rBMSCs的转染效率、转染对细胞的影响以及目的蛋白的表达情况。4.对比观察化学诱导剂、NGF及Noggin对rBMSCs像神经元样细胞方向分化的诱导作用。5.探讨携带NGF及Noggin的rBMSCs对PD模型大鼠神经功能的修复作用及其机制。研究方法：1.应用6-OHDA立体定向颅内注射制备PD大鼠模型。用阿朴吗啡皮下注射检测造模是否成功。2.取SD大鼠长骨骨髓作为供体来源,经贴壁筛选法进行体外培养并纯化rBMSCs。通过细胞表面标志、成骨细胞诱导和成脂细胞诱导对培养的细胞进行鉴定。3.通过不同浓度的重组腺病毒选择转染最合适的MOI值。将rBMSCs分成5组分别为未转染组、Ad-GFP转染组、Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin联合转染组,观察转染对rBMSCs生长的影响,通过免疫荧光检测目的蛋白的表达。4.通过化学诱导剂和基因修饰诱导rBMSCs向神经元样细胞方向分化,并检测其神经细胞标志物的表达。5.通过立体定向颅内注射将经过基因修饰的rBMSCs移植入模型大鼠损毁侧纹状体。记录单位时间阿朴吗啡诱发的模型大鼠旋转次数,观察大鼠神经功能恢复情况。通过免疫荧光检测移植细胞在脑内存活、分布以及向神经元、星形胶质细胞方向分化的情况。免疫组化法检测细胞移植后第四周大鼠中脑黑质TH阳性细胞计数。通过高效液相检测大鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量。结果：1.6-OHDA颅内注射制备的帕金森病大鼠模型具有良好的稳定性,该模型的制备为下一步实验奠定了基础。2.贴壁法能够筛选获得纯度较高,活性良好的rBMSCs,具有相关表型,能向成骨细胞和成脂细胞分化。3.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell条件下对rBMSCs转染效率高,对rBMSCs毒性最小。经NGF、Noggin修饰的重组腺病毒转染后的rBMSCs在发出绿色荧光的同时,能分别表达相应蛋白产物,免疫荧光染色呈红色荧光。联合转染组rBMSCs则同时呈现NGF、Noggin免疫荧光阳性反应。4.rBMSCs在化学诱导剂作用下,5h后出现神经元样形态,免疫荧光染色显示神经元标志物NF(H)呈阳性,星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性,但细胞大量死亡。各转染组rBMSCs中Ad-GFP转染组细胞形态无改变,Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组rBMSCs在转染后72h呈现神经元样形态,部分细胞免疫荧光染色显示NF(H)阳性,GFAP阴性,分化后的细胞可长期存活。其中联合转染组NF(H)阳性率最高。5.经立体定向将细胞移植入模型大鼠损毁侧纹状体一周后,大鼠神经功能均有所改善,由阿朴吗啡诱发的旋转次数明显减少,其中联合转染组最为明显。镜下发现,移植细胞自注射部位向周围扩散,分布于纹状体、皮层下、海马及对侧半球。移植后两周,免疫荧光检测部分存活移植细胞NF(H)有阳性表达,另有部分细胞呈GFAP阳性。联合转染组NF(H)和GFAP阳性细胞比例最高。移植后四周,免疫组化检测各组模型黑质TH阳性细胞生存率,基因修饰组有增多的趋势,但各组差异无统计学意义。高效液相检测大鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量损毁侧同健侧之比,各细胞移植组比值均较未移植组和PBS组高,其中Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin联合转染组比值最高。结论：1.6-OHDA立体定向颅内注射法制备PD大鼠模型具有良好的稳定性及可重复性。2.通过贴壁筛选法能有效纯化骨髓,获得高纯度rBMSCs,并且该方法简单实用,对细胞影响小,能满足大多数研究需求。通过流式细胞技术检测细胞表面标志,以及成骨、成脂诱导能够对rBMSCs进行有效鉴定。3.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin均能安全、有效地转染体外培养的大鼠BMSCs,并稳定表达GFP、NGF和Noggin蛋白。4.体外环境下,化学诱导剂和NGF和Noggin蛋白均能将rBMSCs诱导成为神经元样细胞,但化学诱导剂对细胞存活有明显影响,而后两者不影响细胞存活,并可促进细胞向神经元方向分化。5.立体定向将基因修饰的rBMSCs移植入大鼠损毁侧纹状体,移植细胞可在脑内存活、迁移并分化为具有神经元或星形胶质细胞表型的细胞,通过多种途径有效改善模型大鼠神经功能,促进DA的释放。