猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆与原核表达

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应用Marc-145细胞扩增猪繁殖与呼吸综合征福州株病毒(PRRSV FZ),根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR的方法扩增PRRSV FZ株的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pMD 18 simple T Vector中并转化入大肠杆菌DH5α中,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析。结果表明,PRRSV FZ株与AY885248.1株的ORF5基因核苷酸的同源为100%,与BJ-4株的核苷酸同源性为99.5%,与美洲株VR-2332的核苷酸同源性为99.3%,而与欧洲型(LV)毒株的同源性则为27.1%,因此此株病毒属于美洲型毒株。阳性重组的质粒克隆到原核表达载体pGEX-6p-1(+)上,筛选阳性克隆进行酶切与序列鉴定,结果表明重组表达载体构建成功。将鉴定为阳性的重组表达质粒转化入表达菌E.coli BL21中,鉴定为阳性者用IPTG进行诱导表达,原核表达产物通过SDS-PAGE电泳检测和Western Blotting分析表达产物特性,结果表明表达的融合GP5蛋白分子量为48.5 kDa,表达产物以包涵体的形式存在,重组蛋白与PRRSV单克隆抗体具有良好的免疫反应原性。
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