登革病毒(Dengue virus,DENV)为单正链RNA病毒。该病毒经蚊传播,主要流行于热带、亚热带地区。目前,全球每年约有3.9亿人感染DENV,其中9600万人有临床症状。DENV可以分为4种血清型,即DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4,其中DENV-2流行最为广泛。其感染引起的临床表现有:无症状感染、登革热和登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)。迄今尚无治疗DENV感染的特效药物。在病毒与宿主细胞长期的相互作用中,病毒发展形成了一系列有利于其增殖、传播和抵抗宿主防御等复杂策略,其中包括利用宿主因子入胞、翻译、复制、组装和释放等。当病毒在宿主细胞内进行增殖时,宿主本身的一些分子为应对病毒的感染也会诱导免疫应答而抑制其复制。固有免疫应答是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,其中模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)对于病毒的识别是其启动的关键。RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLR)分子中的视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)和黑素瘤分化因子5(melanoma differentiation factor 5,MDA5)是宿主细胞应答DENV感染的重要PRR,而RLR属于DEx D/H-box解旋酶家族成员。多项研究表明,包括RLR在内的DEx D/H-box解旋酶家族成员在多种病毒的免疫识别和基因组复制中发挥重要作用。本课题组前期在HEK 293T细胞中过表达十几种DExD/H-box解旋酶分子并评价了其对DENV-2复制的影响,发现DDX21、DDX50和DDX17分子能够抑制或促进DENV-2的复制,并已经详细研究了DDX21在DENV-2复制中的作用。同时,DENV-2 NS3蛋白是一个多功能蛋白分子,在病毒的复制和多聚蛋白前体加工成熟中起着重要作用,这些作用的发挥与宿主蛋白的相互作用密切相关。为此,本研究首先对DDX50和DDX17分子在DENV-2复制中的作用机制进行了研究,然后利用亲和层析纯化技术筛选了与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白,选取了线粒体上的一个宿主分子,即丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC),研究了其在DENV-2复制过程中的作用机制。本文的主要内容如下:一、研究目的明确DEx D/H-box解旋酶家族分子(DDX50和DDX17)在DENV-2复制中的作用机制;亲和筛选参与DENV-2复制的新宿主蛋白及研究PC分子的作用机制。二、主要实验方法及结果1.DDX50在DENV-2复制中的作用机制研究为了探究DDX50在DENV-2复制中的作用机制,首先观察了DDX50对DENV-2复制的影响。在HEK 293T细胞中分别沉默或者过表达DDX50后感染DENV-2(MOI=0.1/1),RT-qPCR检测结果显示:沉默DDX50后,在病毒感染12 h和24 h后,DENV-2 RNA水平与对照组相比有所增加(P<0.05);过表达DDX50后,在MOI=0.1时,感染12 h和24 h后DENV-2 RNA水平与对照组相比有降低趋势,在MOI=1时,感染12 h和24 h后DENV-2 RNA水平与对照组相比都有所降低(P<0.05),特别是在12 h,DENV-2 RNA水平显著降低(P<0.01)。收集HEK 293T过表达DDX50后感染DENV-2(MOI=1)24 h的培养液进行空斑试验。空斑实验结果显示,过表达DDX50组中空斑数与对照组相比,数量减少。这些结果提示DDX50能够抑制DENV-2早期的复制,在DENV-2感染细胞中过表达DDX50可以减少病毒颗粒的产生。为探讨DDX50是否通过诱导IFN-β的表达而抑制DENV-2的复制,在HEK 293T细胞中分别沉默DDX50或者过表达DDX50后感染DENV-2(MOI=1),利用RT-qPCR检测IFN-βmRNA表达水平。结果显示:沉默DDX50组与对照组相比,感染病毒24 h后IFN-βmRNA水平有所降低(P<0.05);过表达DDX50后,与对照组相比,感染病毒24 h后IFN-βmRNA表达水平显著升高(P<0.001)。IFN-β-luc双荧光素酶报告系统检测结果显示,HEK 293T细胞内过表达DDX50后,与对照组相比,过表达DDX50组荧光素酶活性比值升高(P<0.05),这提示DDX50本身可以增强IFN-β启动子活性。过表达DDX50后感染DENV-2,与对照组相比,同样可以增强IFN-β启动子活性(P<0.05)。转染poly(I:C)的情况下,过表达DDX50也可以增加IFN-β启动子活性(P<0.05)。NF-κB-luc双荧光素酶报告系统检测结果显示,HEK 293T细胞过表达DDX50后感染DENV-2,与对照组相比,过表达DDX50组荧光素酶活性比值显著升高(P<0.001),这说明DDX50可以增强NF-κB启动子活性。这些结果提示:DDX50可诱导IFN-β的表达来抑制DENV-2的复制,其中DDX50可通过激活NF-κB通路产生IFN-β。为观察DDX50是否与RIG-I或MDA5具有协同作用,在HEK 293T细胞中共转染DDX50和RIG-I或者DDX50和MDA5,分别在未感染和感染DENV-2后检测IFN-β-luc荧光素酶水平。结果显示,不论是在未感染还是感染DENV-2的情况下,共转染组与对照质粒组相比,荧光素酶活性比值都有所升高(P<0.05)。HEK 293T和HeLa细胞感染DENV-2后进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察结果显示DDX50的位置并没有改变,依然位于核内。这些结果提示:DDX50和RIG-I或者MDA5对IFN-β启动子活性的诱导具有协同效应,而且DDX50有可能在核内作为IFN-β的共转录因子而发挥作用。为进一步观察DDX50是否可以诱导干扰素诱导基因(IFN-stimulated gene,ISG)的产生,在HEK 293T细胞中共转染DDX50与ISRE-luc报告质粒或过表达DDX50后感染DENV-2,通过双荧光素酶报告系统或RT-qPCR检测ISG表达水平。结果显示:过表达DDX50组ISRE-luc荧光素酶活性比值显著升高(P<0.001)。过表达DDX50可以引起一些ISG分子,即黏病毒抗性1(myxovirus resistance 1,Mx1)、寡腺苷酸合成酶1(Oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、干扰素诱导表达跨膜蛋白3(IFNinduced transmembrane 3,IFITM3)和ISG15 mRNA表达水平的上调(P<0.05)。这些结果提示,DDX50可能通过上调一些ISG的表达来抑制DENV-2的复制。2.DDX17在DENV-2复制中的作用机制研究为了探究DDX17在DENV-2复制中的作用机制,首先研究了DDX17在DENV-2复制中是否发挥作用。在HEK 293T细胞中分别沉默和过表达DDX17后感染DENV-2(MOI=1/0.5/0.1),RT-qPCR检测结果显示沉默DDX17后,在病毒感染12 h后,DENV-2 RNA水平与对照组相比显著降低(P<0.001)。过表达DDX17后,在病毒感染12 h和24 h后,DENV-2 RNA水平与对照组相比明显增加(P<0.01)。这表明DDX17在病毒复制早期可以促进DENV-2的复制。然后对DDX17是否通过影响IFN-β的产生而发挥作用进行了研究。通过IFN-β-luc双荧光素酶报告系统发现在HEK 293T和HeLa细胞中过表达DDX17后,与对照组相比,过表达组荧光素酶活性比值降低(P<0.01)。这提示在HEK 293T和HeLa细胞中,DDX17可能抑制IFN-β启动子活性。在感染DENV-2(MOI=1)后,通过IFN-β-luc双荧光素酶报告系统进行检测,结果显示过表达组荧光素酶活性比值与对照组相比不具有统计学意义。故DDX17可抑制IFN-β的表达来促进DENV-2的复制,且不依赖于病毒存在与否。为明确DDX17是通过与DENV-2的病毒蛋白还是与病毒RNA相互作用而发挥作用,我们对其进行了进一步的探索。激光共聚焦显微镜观察结果显示,在感染DENV-2的HEK 293T细胞中,DDX17分布在细胞核和胞浆中,并且和DENV-2dsRNA有共定位。在胞浆中,我们还观察到DDX17和病毒NS3蛋白有共定位。在HEK 293T细胞中过表达HA-DDX17后感染DENV-2,RIP实验结果表明,与IgG对照组相比,结合有HA抗体的实验组中可以扩增出DENV-2片段。这些结果提示DDX17可以结合DENV-2的RNA,并有可能作为病毒复制复合体的一部分参与病毒复制。为了观察DDX17是否与其他宿主蛋白存在相互作用,从而参与病毒复制复合体,我们检测了Ras-Gap-SH3区结合蛋白1(Ras-Gap-SH3 domain binding protein 1,G3BP1)在DENV-2感染细胞中的分布情况。在HEK 293T细胞感染DENV-2后进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察结果显示:G3BP1在胞浆内成弥散性分布,不形成应激颗粒(stress granule,SG)。在感染病毒的细胞中,可以观察到DENV-2dsRNA、DDX17和G3BP1共定位于胞浆中,并且DENV-2 NS3、DDX17和G3BP1也可以共定位于胞浆中。免疫共沉淀实验结果表明DDX17和G3BP1可以相互作用,并且在HEK 293T细胞中同时过表达DDX17和G3BP1后感染DENV-2(MOI=1),RT-qPCR检测结果显示DENV-2 RNA水平升高。空斑试验结果显示,DDX17与G3BP1共转染组中空斑数与转染对照质粒组相比,数量有所增加。这些结果提示:DDX17和G3BP1可能位于病毒复制复合体中参与病毒的复制,并且可以增加病毒颗粒的产生与分泌。3.PC在DENV-2复制中的作用机制研究DENV NS3蛋白是一个多功能蛋白,在病毒基因组复制和多聚蛋白前体加工成熟过程中发挥重要作用。为筛选与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白,将含有亲和标签的NS3质粒(pCI-NS3-SF-TAP)转染HEK 293T细胞进行亲和层析纯化,并用1D电泳选出差异条带做质谱分析。结果表明,PC、人60 kD热休克蛋白(heat shock protein family D(Hsp60)member 1,HSPD1)、苯丙氨酰-tRNA合成酶α链(Phenylalanyl-tRNA synthetase alpha chain,FARSA)和波形蛋白Vimentin等是与DENV-2 NS3相互作用的主要候选宿主蛋白。鉴于线粒体在病毒复制中的重要作用,我们选取了线粒体膜上的蛋白PC作为研究对象,进一步研究其在DENV-2复制过程中的作用及其机制。激光共聚焦显微镜观察结果表明,PC分布于A549和HEK 293T细胞的胞浆中,并且DENV-2感染后,PC与胞浆中的DENV-2 NS3蛋白存在共定位。免疫共沉淀结果显示PC和NS3存在相互作用。通过PC相关截短体和NS3进行免疫共沉淀实验,结果显示NS3可以和PC的羧基转移酶区(carboxyltransferase,CT)相互作用。为明确PC在DENV-2复制中的作用,我们在A549细胞中过表达PC后再感染DENV-2(MOI=0.5/1),RT-qPCR检测结果表明,DENV-2 RNA水平与对照组相比有所降低(P<0.05)。HEK 293T细胞中过表达PC后再感染DENV-2(MOI=0.05/0.1/0.5/1),RT-qPCR检测结果表明,DENV-2 RNA水平在感染12 h和24 h后与对照组相比均有所升高(P<0.05)。为观察PC是否通过影响IFN-β的产生而发挥作用,在A549细胞和HEK 293T细胞分别进行了荧光素酶报告系统实验。在A549细胞中,分别在感染DENV-2 12 h和24 h的情况下,过表达PC组与对照组相比,IFN-β-luc双荧光素酶报告系统和NF-κB-luc双荧光素酶报告系统中荧光素酶活性比值都有所升高(P<0.05)。在HEK 293T细胞中,分别在感染DENV-2 12 h和24 h的情况下,在过表达PC组中,IFN-β-luc双荧光素酶报告系统和NF-κB-luc双荧光素酶报告系统中荧光素酶活性比值与对照组相比都不具有统计学意义。这些结果提示,PC在不同细胞系中对DENV-2复制的影响不同,而且PC对于诱导IFN-β的表达有可能具有细胞特异性。将DENV-2分别感染A549细胞和HEK 293T细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示,胞浆中的PC和DENV-2 NS3存在共定位,并且PC和NS3在线粒体上存在共定位。为进一步分析DENV-2是否通过NS3和PC在线粒体上的相互作用来干扰下游信号的传递,DENV-2分别感染A549、HEK 293T和Huh7细胞,48 h后通过Mito Tracker将线粒体染色后进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察结果显示:在A549细胞中,感染DENV-2的细胞中线粒体形态变短;在HEK 293T细胞中,感染DENV-2的细胞中线粒体形态略有变长;在Huh7细胞中,感染DENV-2的细胞中线粒体形态变长。这些结果提示DENV-2对于线粒体形态的影响可能具有细胞特异性。三、结论1.在DENV-2感染早期,DDX50可以抑制DENV-2的复制。首先,DDX50可以通过诱导IFN-β的表达来抑制病毒复制。其次,DDX50和RIG-I或者MDA5对IFN-β启动子活性的诱导具有协同效应。最后,在病毒感染的细胞中,DDX50还可以增强一些ISG的表达,增强抑制病毒复制的作用。2.在DENV-2感染早期,DDX17可以促进DENV-2的复制。一方面,DDX17可以抑制IFN-β的表达;另一方面,DDX17可以和DENV-2 ds RNA相互作用参与病毒的复制,在病毒感染的细胞中它也可以和G3BP1相互作用参与到病毒复制复合物中,从而促进病毒复制并且增加分泌病毒颗粒的产生与分泌。3.在DENV-2感染早期,NS3蛋白与PC存在相互作用,结合区域主要是PC的CT功能区。PC在不同细胞系中对病毒复制的影响不同,即具有细胞特异性。在A549细胞中,一方面PC可以通过诱导IFN-β的表达抑制DENV-2的早期复制;另一方面,PC有可能通过NS3在线粒体上的相互作用影响能量代谢平衡,诱导线粒体自噬,从而抑制DENV-2早期的复制。在HEK 293T细胞中,DENV-2 NS3和PC的相互作用有可能更多的影响了PC或者线粒体上的其他蛋白的活性,进而影响了线粒体的功能,发挥促进DENV-2复制的作用。