地西他滨属核苷类抗肿瘤药物,2006年在美国上市,主要用于骨髓增生异常综合症的治疗,是迄今为止应用最广泛及很有前景的DNA去甲基化抑制剂。地西他滨在体内经脱氧胞苷激酶转化成活性的三磷酸地西他滨,三磷酸地西他滨插入DNA从而抑制DNA的去甲基化,抑制癌细胞的生长。但地西他滨由于有糖基的存在,分子极性很大,导致小肠膜通透性差；而且地西他滨在体内容易被肠道黏膜和肝脏的胞嘧啶脱氨酶作用脱氨,生成无活性的尿苷地西他滨,因此地西他滨口服生物利用度低(仅为9%),在临床上主要以静脉注射的方式给药。目前尚未见对地西他滨进行结构改造以提高口服生物利用度的报道,这样研究适合口服给药的地西他滨前药是非常有意义的。本课题的设计思路是研发出可以被小肠寡肽转运蛋白(oligopeptide transporter1, PepT1)特异识别的地西他滨前药,提高地西他滨的膜渗透性,进而提高其口服生物利用度。本研究首先通过酰化反应和催化氢化合成了5个地西他滨的L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸酯前药,并优化了合成路线和分离纯化方法,使得反应条件较为简单可行且提高了目标产物的收率。利用Caco-2细胞模型研究了5个地西他滨5’位氨基酸酯类前药和母药地西他滨的膜通透性,其中L-缬氨酸酯前药(5’-O-L-valyl-dac)和L-苯丙氨酸酯前药(5’-O-L-phenylanlanyl-dac)的膜渗透率较高,分别为9.94×10-7和1.13×10-6cm/s,是地西他滨的3.28和3.75倍。基于结构的差异和膜渗透性的考虑,选择了脂肪族的5’-O-L-valyl-dac和芳香族的5’-O-L-phenylanlanyl-dac作为代表性的先导化合物,对其吸收机制、稳定性和体内药物动力学进行深入研究。Gly-Sar(PepTl的典型底物)的摄取抑制实验表明,Gly-Sar的摄取可以被5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac所抑制,且呈现浓度依赖性,半数抑制浓度(IC50)分别是2.20±0.28mM and3.46±0.16mM;母药DAC对Gly-Sar的摄取几乎没有抑制作用。利用瘦素(leptin)来诱导Caco-2细胞高表达PepTl,实验结果表明,和正常Caco-2细胞相比,5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac的摄取在leptin诱导的Caco-2细胞上有显著提高；而母药地西他滨的摄取没有显著提高。综上,体外细胞实验表明5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac均为PepT1的底物,而母药地西他滨不是PePT1的底物。体外稳定性研究结果表明,化合物5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac在系列pH值磷酸盐缓冲液中的稳定性随着pH的升高而逐渐下降。5’-O-L-valyl-dac在小肠匀浆、肝匀浆和血浆中的半衰期分别为61,5和86min,5’-O-L-phenylanlanyl-dac在小肠匀浆、肝匀浆半衰期分别为7和2min,血中半衰期极短,没有检测到。在大鼠胃液、小肠液中,两个化合物都在1.5h以上,较为稳定。这预示着前药在胃肠道中应该能保持较好的稳定性,经肠道PePT1介导吸收后在体内应该能很快的生物活化为地西他滨,发挥药理活性。此外,相对于5’-O-L-valyl-dac,5’-O-L-phenylanlanyl-dac进入体内后能够更加快速地激活。大鼠体内药动学研究表明,相同剂量下(15mg/kg,以地西他滨计),口服5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac的生物利用度分别由口服地西他滨的26.9%提高到46.7%和50.9%。另外体内吸收抑制性实验表明,同时给服Gly-Sar(150mg/kg),会导致两个化合物吸收降低,但仍高于口服母药地西他滨,一方面说明了Gly-Sar可以抑制PepTl对5’-O-L-valyl-dac和5’-O-L-phenylanlanyl-dac的转运,另一方面也说明了PepTl的转运能力比较强,属于高转运容量的载体蛋白,基于它的相互作用强度并不显著。