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2010年4月以来,中国南部城市爆发了一种以产蛋鸭产蛋量急剧下降为特征的流行病,并迅速漫延到山东,河南等中部城市。2011年,该病被命名为“鸭坦布苏病毒病”,该病感染率高,死亡率低,主要以产蛋量急剧下降为主要特征,肉鸭,雏鸭主要症状为站立困难,步态不稳,给养禽业带来了巨大损失。鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属,同种属病毒有登革热病毒,黄热病毒,西尼罗河病毒等危害人体健康的病毒,不排除鸭坦布苏病毒感染哺乳动物并引发疾病的可能性。鸭坦布苏病毒目前尚无有效的疫苗防治,并且其致病机理也尚不明确。因此,对鸭坦布苏病毒基因结构分析及致病性研究是十分必要的。1.鸭坦布苏病毒的分离与鉴定本实验病料来自于湖北省麻城某发病鸭场。自然感染病鸭出现匍匐不能站立,划水状姿势,产蛋量由50%下降至0。病鸭脑组织出现“血管袖套”“噬神经元”等典型的非化脓性脑炎症状,脾组织淋巴细胞减少,卵泡粒膜与内膜分离。将自然感染病鸭脑组织匀浆,经RT-PCR初步鉴定为鸭坦布苏病毒。病鸭脑组织匀浆液经尿囊腔接种10日龄鸭胚,发现病毒可导致鸭胚胚体出血,胚体变小,肝有黄色斑块。收获的病毒尿囊液感染DEF细胞,经增殖后收集含病毒的细胞液。将收获的病毒细胞液感染BHK细胞,感染后48h开始出现细胞病变,BHK细胞出现圆缩,72h出现明显的细胞病变。病毒的鸭胚半数致死量和蚀斑单位分别为10-4.42ELD50/0.3mL和4.72×107pfu/m L,BHK细胞的间接荧光试验发现病毒出现在BHK细胞的细胞质中,血凝试验发现病毒不凝集鸡红细胞。电子显微镜下观察,病毒粒子为圆形,直径为40~60nm,有囊膜。综上可确定实验室分离的毒株为鸭坦布苏病毒,并将其命名为MC株。2.鸭坦布苏病毒全序列的测定RT-PCR测定病毒全序列,拼接后进行分析。测得的病毒全基因组序列上传GenBank并将其命名为MC株。鸭坦布苏病毒MC株全基因组序列与黄病毒科黄病毒属的代表毒株做遗传进化分析,发现其与Sitiawan virus处于同一分支,亲缘性最近。同源性比对发现,其与Sitiawan virus的同源性较高,为87.1%,与Yellow fever virus的同源性最低,为53.1%。MC株全基因组序列长10990bp,仅含有一个开放性阅读框,大小为10278bp,共编码3425个氨基酸。蛋白裂解位点与其他黄病毒相似,阅读框由3个结构蛋白(PrM,C,E)和7个非结构蛋白组成(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5)。糖基化位点预测发现MC株在非结构蛋白NS5的数量与其他坦布苏病毒有差异。RNAfold预测基因组非编码区二级结构发现,MC株与其他黄病毒相似,在5’端非编码序列有大茎环结构SLA,小茎环结构SLB。3’非编码区有茎环结构3’SL。MC株在3’端非编码区的保守序列与其他坦布苏病毒相似性极高。蛋白序列同源性分析发现与其他鸭坦布苏病毒的同源性均在97%以上。3.MC株鸭坦布苏病毒对麻鸭雏鸭的致病性MC株鸭坦布苏病毒接种7日龄的雏鸭,攻毒后7天,全部剖杀,将心,肝,脾,肺,肾,脑等组织用10%福尔马林固定;同时取脑组织匀浆,RT-PCR检测,结果发现人工感染组3个鸭坦布苏病毒阳性。病理组织学观察发现3只检测到病毒的鸭脑组织出现“血管袖套”“噬神经元”等典型的非化脓性脑炎症状,脾组织白细胞减少,免疫组织化学染色发现其阳性信号出现在脑组织神经元细胞的细胞质中以及脾等其他组织内红细胞的细胞质中。