研究背景卵巢癌是一个由不同临床病理和分子特征的异质性卵巢肿瘤组成的集合。在全球范围内,卵巢癌都是最致命的妇科恶性肿瘤。尽管有不少研究者对新型化学疗法、靶向疗法和其他疗法进行了研究,但卵巢癌的临床结果和治愈率仍未得到明显改善。目前,卵巢癌患者的5年总生存率仅为45%,而晚期卵巢癌患者的预后更差,5年生存率约为10～30%。手术联合化疗是卵巢癌的主要治疗方法,但因卵巢在解剖学上位于盆腔深部,早期无临床症状,晚期多出现腹胀、胃肠道消化不良等腹部疾病通有的症状,缺乏特异性症状、体征和早期诊断生物标记物,70%患者发现即是晚期。治疗后的普遍复发及耐药也给卵巢癌的治疗带来了巨大挑战。了解确切的侵袭转移机制对于晚期卵巢癌的治疗具有重要意义。据报道有数种信号通路,特别是信号传导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3)通路参与了卵巢癌的发生发展。STAT3作为STAT转录因子家族的一员,具有增强卵巢癌侵袭和转移能力的作用。在受到细胞因子和生长因子的刺激后,STAT3可以被受体相关的Janus激酶磷酸化,从而导致STAT3核易位并激活诸如CCND1和MMP9等靶基因。因此,STAT3信号通路被认为是卵巢癌的有希望的治疗靶标。PDZ和LIM域蛋白4(PDZ and LIM domain protein 4,PDLIM4)是PDLIM家族的成员,该家族由保守的PDZ和LIM域组成,已被证明参与肌动蛋白的细胞骨架重塑和细胞运动。不少研究结果表明PDLIM4参与肿瘤的进展。例如,PDLIM4过表达抑制结肠癌细胞的生长和克隆形成。PDLIM4在前列腺癌组织中的表达相对于邻近的良性组织下调,并表现出抑制前列腺癌细胞细胞周期进程作用。尽管已有这些研究报道,但目前的研究尚未明确PDLIM4在卵巢癌中的表达和作用。本研究拟测定PDLIM4在卵巢癌中的表达及其预后意义,表征PDLIM4在卵巢癌细胞的生长、侵袭和肿瘤发生中的作用,并探讨所涉及的信号传导途径。本研究为了阐述PDLIM4在卵巢癌进展中的作用及机制,先检测了 PDLIM4在卵巢癌组织中的表达情况,并分析PDLIM4表达与卵巢癌患者临床病理参数之间的关系。再通过细胞模型探究了 PDLIM4对卵巢癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和STAT3信号通路的影响。最后通过体外实验裸鼠移植瘤模型探究了 PDLIM4过表达对裸鼠移植瘤生长以及组织中Ki-67和p-STAT3表达的影响。本研究分为三部分:第一部分:PDLIM4在卵巢癌中的表达和临床意义研究;第二部分:PDLIM4对卵巢癌生长和侵袭的影响研究;第三部分:PDLIM4通过STAT3抑制卵巢癌进展的机制研究。第一部分PDLIM4在卵巢癌中的表达和临床意义研究目的检测PDLIM4在卵巢癌组织中的表达水平;探讨PDLIM4表达与患者临床病理特征和预后的相关性。方法收集郑州大学第一附属医院诊治的原发性卵巢癌患者92例卵巢癌组织和35例邻近正常卵巢组织。采用免疫组化染色法检测PDLIM4在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达情况;采用χ2检验分析PDLIM4表达与患者年龄、肿瘤分期、组织学类型和淋巴结转移之间的关系;采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析PDLIM4高、低表达组卵巢癌患者的总生存期的差异。结果1 PDLIM4在卵巢癌组织中的阳性表达率为30.37%,明显低于正常卵巢组织中的阳性表达率86.12%;卵巢癌组织的PDLIM4免疫组化评分也明显低于正常卵巢组织,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。2 PDLIM4表达水平与患者的肿瘤分期显著相关(P=0.003),与患者是否发生淋巴结转移也显著相关(P<0.001),但PDLIM4表达水平与患者的年龄和组织学类型无显著相关性(P>0.05)。3 PDLIM4低表达与卵巢癌患者较短的总生存时间显著相关(P=0.014)。结论1 PDLIM4在卵巢癌组织中呈低表达状态。2 PDLIM4表达与卵巢癌患者的肿瘤分期和淋巴结转移明显相关。3 PDL1M4表达下调与卵巢癌患者的不良预后相关。第二部分PDLIM4对卵巢癌生长和侵袭的影响研究目的检测PDLIM4在卵巢癌细胞中的表达水平;探讨PDLIM4对卵巢癌细胞生长、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法1采用Western Blot和荧光定量PCR法测定PDLIM4在CAOV3、OVCAR、SKOV3卵巢癌细胞和IOSE80正常卵巢上皮细胞中的表达。2构建过表达PDLIM4的真核表达质粒PDLIM4 cDNA,并转染CAOV3和SKOV3细胞。3采用Western Blot鉴定PDLIM4在转染质粒的CAOV3和SKOV3细胞中的表达。4采用细胞计数、EdU染色法和细胞克隆形成实验检测PDLIM4过表达对CAOV3和SKOV3细胞增殖的影响。5采用PI染色,通过流式技术分析过表达PDLIM4对卵巢癌细胞周期的影响。6采用Annexin-V/PI染色,通过流式技术分析过表达PDLIM4对卵巢癌细胞凋亡的影响。7采用细胞划痕实验和Transwell实验检测PDLIM4对CAOV3和SKOV3细胞迁移和侵袭能力的影响。8通过体外异种移植瘤模型观察PDLIM4对卵巢癌组织生长的影响。结果1 CAOV3、OVCAR3和SKOV3卵巢癌细胞中PDLIM4的mRNA和蛋白水平明显低于正常卵巢上皮细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 CAOV3和SKOV3卵巢癌细胞转染PDLIM4后,细胞中PDLIM4的表达明显增加,分别是空载体转染细胞的3.48和6.12倍(P<0.05)。3与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著抑制CAOV3和SKOV3细胞数量和增殖率增长,差异具有统计学意义(P<0.05)。4与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著诱导CAOV3和SKOV3细胞G0/G1期阻滞,差异具有统计学意义(P<0.05)。5与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著促进CAOV3和SKOV3细胞凋亡,差异具有统计学意义(P<0.05)。6与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著抑制CAOV3和SKOV3细胞集落形成,差异具有统计学意义(P<0.05)。7与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著抑制CAOV3和SKOV3细胞的迁移和侵袭能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。8与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达卵巢癌细胞诱导的移植瘤体积和重量显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1在卵巢癌细胞中,PDLIM4mRNA和蛋白表达均降低。2 PDLIM4过表达在卵巢癌中抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,发挥抑癌作用。3 PDLIM4过表达抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生长。第三部分PDLIM4通过STAT3抑制卵巢癌进展的机制研究目的探讨PDLIM4抑制卵巢癌细胞和移植瘤生长和侵袭的可能机制。方法1采用Western Blot法检测PDLIM4过表达对CAOV3和SKOV3细胞中p-STAT3和STAT3表达的影响;采用RT-PCR法检测PDLIM4过表达对CAOV3和SKOV3细胞中CCND1和MMP9的影响;采用双荧光素酶报告系统对CAOV3和SKOV3细胞中STAT3萤光素酶活性的影响。2采用挽救实验检测活化型STAT3(CA-STAT3)过表达对PDLIM4抑制的STAT3萤光素酶活性的影响;RT-PCR检测PDLIM4过表达对卵巢癌细胞中CCND1和MMP9表达的影响;通过细胞计数和细胞克隆形成实验评价CA-STAT3过表达对PDLIM4抑制的卵巢癌细胞增殖的影响;采用Transwell实验检测CA-STAT3过表达对PDLIM4抑制的卵巢癌细胞侵袭能力的影响。3通过体外异种移植瘤模型观察CA-STAT3对PDLIM4抑制的卵巢癌组织生长及PDLIM4对组织中Ki-67和p-STAT3表达的影响。结果1与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著抑制CAOV3和SKOV3细胞中p-STAT3的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);PDLIM4过表达对STAT3的表达无明显影响,但明显减弱CAOV3和SKOV3细胞中STAT3萤光素酶活性。2与空载体转染的细胞相比较,PDLIM4过表达显著抑制CAOV3和SKOV3细胞中CCND1和MMP9的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。3与PDLIM4过表达细胞相比较,CA-STAT3过表达明显恢复卵巢癌细胞中STAT3萤光素酶活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。4与PDLIM4过表达细胞相比较,CA-STAT3过表达明显恢复卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。5与空载体转染的细胞相比较,CA-STAT3恢复PDLIM4过表达抑制的移植瘤体积,肿瘤组织中Ki-67和p-STAT3表达也明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1 PDLIM4阻断STAT3的磷酸化激活并抑制靶基因CCND1和MMP9的表达,从而在卵巢癌中发挥抗肿瘤作用。2 PDLIM4下调卵巢癌移植瘤中Ki-67和p-STAT3表达,可能是卵巢癌的潜在治疗靶标。