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目的2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是与肥胖相关疾病。目前管理体重的方式为限制能量摄入和开展减肥手术。但对于部分人群来说很难达到理想的效果。近年来,新的药物不断涌现,研究发现通过某些作用机制可以有效抵抗肥胖及其他代谢异常表现。钠葡萄糖共转运蛋白 2 抑制剂(Sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors,SGLT2i)已成为治疗2型糖尿病的新型降糖药物。最近有研究报道,SGLT2抑制剂恩格列净(Empagliflozin,Empa)增加白色脂肪的利用促进褐变,减轻体重。但其对能量稳态与肥胖作用的潜在机制尚未确定。因此,本研究以KKAy小鼠和前脂肪细胞系(3T3-L1)为研究对象,通过体内和体外实验研究并探讨恩格列净在白色脂肪棕色样变中的作用及其机制。方法1.动物实验:以自发性2型糖尿病KKAy小鼠为模型,随机分为三组,第一组(DM+Empa)组,第二组(DM)组,第三组(DM+Insulin)组。C57BL/6J小鼠模型为(NC组)。16周时,测量小鼠空腹血糖,体重,肛温。16周饲养结束分离小鼠肾周脂肪(Peripheralrenal WAT,pWAT)和附睾脂肪(Epididymal WAT,eWAT)。采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot及免疫荧光的方法检测肾周和附睾白色脂肪组织脂代谢、线粒体生物合成、线粒体动力学和线粒体氧化磷酸化标志性基因的mRNA和蛋白表达水平,提取脂肪组织线粒体测定Complex I和α-KGDH酶活性,观察恩格列净在白色脂肪棕色样变中的作用。此外,测定DM+Insulin组线粒体生物合成、线粒体动力学指标,观察血糖变化对白色脂肪线粒体棕色样变的作用。2.体外实验:采用3T3-L1前脂肪细胞,诱导5天成脂。然后分为两组:一组为对照组(Vehicle),另一组为恩格列净组(4μmol/L)干预3天。JC-1染色检测脂肪细胞线粒体膜电位功能。提取脂肪细胞线粒体检测电子呼吸链Complex I和α-KGDH酶活性。使用AMPK激活剂和抑制剂了解恩格列净对脂肪细胞线粒体棕色样变的影响。利用PGC-1α siRNA进行细胞转染,观察线粒体动力学指标Mfn2变化,进一步阐明恩格列净通过介导PGC-1α改善线粒体融合促进白色脂肪棕色样变的作用机制。结果1.动物实验结果(1)恩格列净增加内源性产热,降低体重和血糖,改善脂质代谢和炎症反应。在4小时冷暴露(4℃)期间,DM+Empa组体温升高。此外,DM+Empa组小鼠体重和血糖明显下降(P＜0.05),脂肪酸合成相关基因和炎症因子标志物mRNA的水平降低(P＜0.05)。脂肪酸分解相关基因mRNA水平增加(P＜0.05)。(2)恩格列净增加脂肪线粒体三羧酸循环(TCA)和电子传递链(ETC)功能。恩格列净增加脂肪组织TCA和ETC mRNA表达水平(P＜0.05)。增加电子传递链复合物蛋白水平(P＜0.05)。增加脂肪组织线粒体ComplexⅠ和α-KGDH酶活性(P＜0.05)。(3)恩格列净增加线粒体生物合成。DM组线粒体生物合成标志性因子减少,而恩格列净干预后可以改善线粒体生物合成。(4)恩格列净增加脂肪线粒体动力学蛋白表达。恩格列净增加Mfn2蛋白表达(P＜0.05)。胰岛素组脂肪组织线粒体生物合成和线粒体动力学蛋白表达下降(P＞0.05),而恩格列净可以改善脂肪组织中线粒体生物合成和线粒体动力学蛋白表达(P<0.05)。2、细胞实验结果(1)恩格列净抑制脂肪细胞脂滴的形成,改善脂肪细胞脂质代谢和炎症反应。恩格列净干预后脂滴体积减小,数量减少。此外,恩格列净减少脂肪酸合成因子和炎症因子mRNA表达水平(P＜0.05)。增加脂肪酸分解因子mRNA表达水平(P＜0.05)。(2)恩格列净激活AMPK/PGC-1α通路增加脂肪线粒体功能。恩格列净增加脂肪细胞AMPK,PGC-1α,TFAM和Nrf2蛋白表达。此外,恩格列净能够改善脂肪细胞TCA和ETC功能。(3)恩格列净通过激活AMPK/PGC-1α通路促进线粒体生物合成和白色脂肪棕色化恩格列净增加脂肪细胞COX Ⅳ表达(P＜0.05)。激活或抑制AMPK,恩格列净可增加或降低线粒体棕色样变和线粒体生物合成因子的表达。(4)PGC-1α作为关键因子参与调节脂肪细胞Mfn2表达恩格列净增加脂肪细胞Mfn2蛋白表达。低表达PGC-1α可减弱PGC-1α/M fn2信号通路活性。结论1、恩格列净促进线粒体氧化磷酸化,增加三羧酸循环和电子呼吸链功能。2、恩格列净通过AMPK/PGC-1α信号通路促进线粒体融合,增加线粒体稳态,促进白色脂肪棕色样变,从而增加机体内源性产热,改善脂质代谢,减轻体重。3、恩格列净促进白色脂肪棕色样变的作用独立于降糖作用。