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流行性感冒（influenza,简称流感）是由流行性感冒病毒（influenzavirus,简称流感病毒）引起的急性呼吸道传染病,历史上发生的1918-1919年的“西班牙流感”和1957年的“亚洲流感”,以及近年来在全球范围内都影响颇大的甲型H1N1流感和H7N9型禽流感等,造成了大量人员死亡与社会恐慌,成为人类面临的主要公共卫生问题之一[1,2]。流感病毒可以感染呼吸道上皮细胞,是引起急性呼吸道传染病的重要病原体,其通过激发宿主固有免疫应答和适应性免疫应答,引起间质性肺炎,弥漫性肺泡损伤,肺组织充血、水肿、出血等病变,导致流感病毒性肺炎的发生,严重威胁人类健康[3,4]。流感病毒性肺炎在中医属于温病的范畴,主要病机是感受温热毒邪,瘀毒壅肺损伤血络,治疗应注重清热解毒、凉血散瘀。犀角地黄汤合银翘散（Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder,简称XDY）是清代著名温病学家吴鞠通用于“解毒凉血散瘀”的经典合方。现代临床对其多有运用,多位临床医生通过对甲流患者、传染性非典型肺炎患者,以及外感合并再生性障碍贫血、血小板减少性紫癜等出血性疾病的患者使用犀角地黄汤合（或）银翘散治疗,均取得了较好的效果。大量临床研究证明,用银翘散辛凉宣透、以解热毒,犀角地黄汤凉血益阴、以宁血络,两方相合共达解毒凉血散瘀的目的,对于毒犯血络所致的病毒性肺炎具有较好的疗效。研究表明,犀角地黄汤合银翘散对小鼠流感病毒性肺炎具有较好的疗效,能明显降低流感病毒性肺炎小鼠的死亡率,并可以通过抑制流感病毒感染后肺组织中前列腺素2、磷脂酶S2、白三烯B4的释放,提高水通道蛋白的表达,抑制炎性细胞因子及氧自由基的产生等作用,降低肺血管通透性、减轻肺水肿与肺组织出血,减轻肺部炎症。在体外实验中,该合方的含药血清明显抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬细胞内炎性细胞因子、炎性介质及自由基的产生,具有抗炎作用,并可通过抑制磷酸化ERM表达,降低流感病毒所致细胞通透性的升高和细胞骨架的重构,保护微血管内皮屏障。目的在前期研究中,我们从细胞骨架、细胞因子、炎性介质等不同角度探讨了犀角地黄汤合银翘散对流感病毒性肺炎小鼠及流感病毒感染细胞系的影响,但缺少对其治疗机制的全面探讨。微小RNA（micro RNA,简称miRNA）几乎参与了体内已知所有信号通路及病理生理过程的调控,是基因调控网络中的核心成分;在病毒性疾病感染的相关研究中发现,miRNA参与了宿主与病原相互作用的调控;在流感病毒性肺炎发展的过程中,miRNA是流感病毒引起流感病毒性肺炎的重要调节因素。犀角地黄汤合银翘散对流感病毒性肺炎小鼠有明确的疗效,然而其治疗作用在miRNA的水平的调节未见报道,在mRNA水平的影响未见全面研究。因此,本课题拟在前期研究的基础上,以流感病毒性肺炎小鼠为模型,首次通过高通量测序分析,全面展示犀角地黄汤合银翘散在miRNA和mRNA水平的调控,通过miRNA-mRNA的关联互作关系,重点关注其对血管通透性变化、免疫炎症反应、细胞凋亡、抗病毒等相关生物学过程和信号通路的影响,以明确此合方在体内实验中对机体固有免疫应答和适应性免疫的调控,全面解析药物的作用机制,为临床使用“解毒凉血散瘀”经典合方犀角地黄汤合银翘散治疗流感提供实验依据及理论基础。方法1.XDY对流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用整理犀角地黄汤合银翘散对流感病毒性肺炎治疗作用的前期研究,并再次验证了本合方的治疗作用。建立流感病毒性肺炎小鼠模型,并设立正常组、病毒组、XDY组,通过对小鼠体重、毛发、活动力、反应灵敏度、眼神、精神情况等生命状态的观察,以及通过HE染色法观察小鼠肺组织病理变化,从整体层面证明犀角地黄汤合银翘散对流感病毒性肺炎的治疗效果。2.XDY对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中miRNA和mRNA的筛选与功能分析建立流感病毒性肺炎小鼠模型,并设立正常组、病毒组、XDY组,分别于流感病毒感染小鼠第4天、第7天取肺组织,进行高通量测序检测,在基因层面全面展示XDY调控流感病毒性肺炎小鼠肺组织miRNA和mRNA的表达谱,探索本合方对机体免疫应答的调控;并着重挑选了与TLR、Jak-STAT、MAPK、PKC、Ⅰ型干扰素、炎性小体、肿瘤坏死因子等信号通路相关的miRNA和mRNA进行验证。3.XDY对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中miRNA与mRNA影响的验证建立流感病毒性肺炎小鼠模型,并设立正常组、病毒组、XDY组,分别于流感病毒感染小鼠第4天、第7天取肺组织,实时荧光定量PCR检测各组11个miRNA和5个mRNA的表达量。结果1.XDY对流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用通过观察流感病毒性肺炎小鼠整体的生命体征发现,病毒组小鼠毛发稀疏无光泽,眼神暗淡,反应迟钝,体重持续下降呈明显消瘦,而XDY组小鼠与正常组小鼠表现相近,各项生命体征明显优于病毒组小鼠;HE结果表明,病毒组小鼠肺组织表现为间质性炎症,而XDY组小鼠肺组织的病变程度和病变范围均比病毒组具有明显改善,基本接近正常组,从而验证了犀角地黄汤合银翘散对流感病毒性肺炎的良好治疗作用。2.XDY对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中miRNA和mRNA的筛选与功能分析2.1.随着炎症程度的不断增加,病毒组与正常组小鼠肺组织miRNA和mRNA的表达出现明显的差异;XDY组小鼠经过给药干预后,炎症程度具有较明显减轻,而某些差异miRNA和mRNA的表达也出现了明显的变化,提示XDY可能通过调节miRNA影响mRNA的表达,从而对小鼠流感病毒性肺炎起到治疗作用。2.2.根据高通量测序中表达差异的miRNA和mRNA之间多对多的对应关系以及变化的倍数,挑选出 11 个 miRNA（miR-7b-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p、miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-503-5p、miR-669a-3p、miR-351-5p）和 5 个mRNA（Mapk3、Mapk10、Fos、Stat1、Ifnb1）进行进一步分析研究。3.XDY对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中miRNA与mRNA影响的验证3.1.病毒性肺炎小鼠肺组织中miRNA的表达:根据mi RNA高通量测序结果和靶基因预测结果分析后,我们在表达差异的mi RNA中选取了 11个与免疫炎症反应、细胞凋亡、细胞通透性、抗病毒、抗纤维化等过程相关且差异倍数显著的mi RNA进行qRT-PCR验证。实验结果表明,qRT-PCR验证与高通量测序的结果基本一致:病毒组整体趋势下调的有6个mi RNA,上调的有5个mi RNA;XDY组与正常组的表达没有统计学差异。在4dpi时,在病毒组中,miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p相对于正常组表达上调（p<0.001、p<0.01、p<0.001、p<0.001、p<0.001）,miR-351-5p 相对于正常组表达下调（p<0.01）,miR-7b-5p、miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-503-5p、miR-669a-3p的表达相对于正常组和病毒组均无差异（p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05）。在4 dpi时,在XDY组中,miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p、miR-200b-3p相对于正常组表达上调（p<0.001、p<0.01、p<0.001、p<0.001、p<0.001、p<0.05）,但与病毒组无差异（p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05）;miR-351-5p相对于病毒组表达上调（p<0.05）,但与正常组表达无差异（p>0.05）;miR-7b-5p、miR-34c-5p、miR-503-5p、miR-669a-3p的表达相对于正常组和病毒组均无差异（p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05）。在7 dpi时,在病毒组中,miR-7b-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p相对于正常组表达上调（p<0.001、p<0.001、p<0.01、p<0.001、p<0.001）;miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-351-5p、miR-503-5p、miR-669a-3p 相对于正常组表达下调（p<0.001、p<0.001、p<0.001、p<0.001、p<0.01）。在7 dpi时,在XDY组中,miR-7b-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、相对于病毒组表达下调（p<0.01、p<0.01、p<0.05）,但与正常组表达无差异（p>0.05、p>0.05、p>0.05）;miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-351-5p、miR-503-5p 相对于病毒组表达上调（p<0.001、p<0.05、p<0.001、p<0.001）,但与正常组表达无差异（p>0.05、p>0.05、p>0.05、p>0.05）;miR-147-3p、miR-155-5p、相对于病毒组表达下调（p<0.01、p<0.01）,但相对于正常组表达上调（p<0.001、p<0.05）;miR-223-3p相对于正常组表达上调（p<0.001）,相对于病毒组表达无差异但有下调趋势（p>0.05）;miR-669a-3p的表达相对于正常组和病毒组均无差异（p>0.05）。3.2.病毒性肺炎小鼠肺组织中mRNA的表达:Mapk3 m RNA在4 dpi三组表达无明显差异（p>0.05）,在7 dpi病毒组比正常组和XDY组呈明显下调（p<0.001、p<0.001）;在4 dpi和7 dpi,XDY组与正常组相比表达无差异（p>0.05）。Mapk10 mRNA的病毒组相较正常组和XDY组在4 dpi表达明显下调（p<0.01,p<0.05）,在7 dpi下调差异进一步加大（p<0.001,p<0.001）;在4dpi和7 dpi,正常组与XDY组相比表达无差异（p>0.05）。Fos m RNA在4 dpi表达无明显差异,但能看出病毒组有上调趋势（p>0.05）,在7 dpi病毒组比正常组和XDY组呈明显上调（p<0.001,p<0.001）;在4 dpi和7 dpi,正常组与XDY组相比表达无差异（p>0.05）。Stat1 mRNA在4 dpi病毒组和XDY组表达较正常组均显著上调（p<0.001,p<0.001）,而XDY组与病毒组比上调倍数较低,具有显著差异（p<0.001）;在7 dpi病毒组和XDY组表达较正常组均显著下调（p<0.001,p<0.001）,XDY组比病毒组下调具有显著差异（p<0.001）。Ifnb1 m RNA在4 dpi病毒组和XDY组表达较正常组均显著上调（p<0.001,p<0.001）,XDY组比病毒组上调倍数较低但不具有差异（p>0.05）;在7 dpi病毒组表达较正常组和XDY组均显著下调（p<0.001,p<0.01）,而XDY组与正常组相比表达无差异（p>0.05）。结论1.流感病毒感染和XDY干预后,小鼠肺组织中miRNA和mRNA都有较显著变化,差异表达miRNA及mRNA主要参与了 TLR、Jak-STAT、MAPK、PKC、Ⅰ型干扰素、炎性小体、肿瘤坏死因子等多个信号通路。2.根据miRNA和mRNA的联合分析筛选,qRT-PCR验证了miR-7b-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p、miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-503-5p、miR-669a-3p、miR-351-5p的差异表达与高通量测序结果一致,提示XDY可能通过影响以上差异miRNA的表达,调节流感病毒性肺炎发展中的免疫炎症反应、细胞凋亡、细胞通透性、抗病毒、抗纤维化等过程,从而发挥对流感病毒性肺炎的治疗作用。3.根据差异表达的mRNA验证,qRT-PCR结果显示流感病毒感染后相对于正常组ERK和JNK的mRNAMapk3和Mapk 10表达下调,AP-1的mRNAFos表达上调;XDY组中相对于病毒组Mapk3和Mapk 10表达上调,Fos表达下调,与正常组的表达无统计学差异,提示在流感病毒性肺炎疾病发展和XDY的治疗过程中,XDY有可能通过ERK/JNK-AP-1通路对流感病毒性肺炎相关炎症反应的表达进行调控。IFN-β、STAT的mRNAIfnb1和Stat1的表达在病毒组先显著上调后显著下调;在XDY组Ifnb1的表达相对病毒组先显著下调后显著上调,与正常组表达无差异,而Stat1的表达相对病毒组进一步降低,提示STAT和IFN-β存在一定的相关性,但XDY的治疗可能通过不同的通路起作用,有待将来的进一步研究确认。4.XDY干预流感病毒性肺炎的治疗作用机制可能与miR-7b-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147-3p、miR-155-5p、miR-223-3p、miR-34c-5p、miR-200b-3p、miR-503-5p、miR-669a-3p、miR-351-5p及ERK/JNK-AP-1、STAT和IFN-β相关通路的调控有关。