论文部分内容阅读
成年奶牛个体的乳腺伴随着乳腺上皮细胞的增殖、分化和凋亡，一生经历多次与妊娠相关的周期性变化。MicroRNAs(miRNAs)对乳腺发育和泌乳过程中的基因表达发挥重要的调控作用。前期对奶牛不同泌乳阶段乳腺组织的lncRNA-Seq分析显示，miR-21-3p与多个差异表达的lncRNAs具有潜在的相关性。另外有研究报道，miR-21的表达量在奶牛泌乳期和干奶期存在显著差异，但对其在奶牛泌乳周期中的作用尚不清楚。 因此，本研究以奶牛乳腺上皮细胞系（BMECs）为研究对象，首先通过MTT试验和细胞流式分析，探究miR-21-3p对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。在明确miR-21-3p对BMECs的功能后，利用生物信息学软件预测其靶基因，并对靶基因进行验证。接着，在BMECs中过表达miR-21-3p后利用RT-qPCR探究lncRNA NONBTAT017009.2与miR-21-3p的相关性，并进一步通过RT-qPCR和双荧光素酶报告系统研究NONBTAT017009.2与miR-21-3p及其靶基因的调控关系。由于miR-21基因启动子区存在转录因子STAT3的结合位点，且STAT3与鉴定的miR-21-3p靶基因IGFBP5具有潜在的相关性，因此进一步通过双荧光素酶系统探究了转录因子STAT3对miR-21基因启动子活性的影响。通过以上试验，共同揭示了miR-21-3p参与调控奶牛乳腺上皮细胞增殖的作用机制。获得以下结果： 1.奶牛乳腺上皮细胞系中分别转染miR-21-3p mimic（或mimic NC）和miR-21-3p inhibitor（或inhibitor NC）后，MTT试验结果表明，与对照组相比，过表达miR-21-3p显著增强了细胞活力（P<0.05），抑制miR-21-3p的表达后显著抑制了细胞活力（P<0.05）。细胞流式分析结果发现，miR-21-3p mimic组G2期的细胞数目明显增加，G2+S期的百分数与对照组相比增加了10.8%；miR-21-3p inhibitor组G2期的细胞数目明显降低，G2+S期的百分数与对照组相比减少了10.2%，表明miR-21-3p具有促进细胞增殖的作用。 2.双荧光素酶试验结果显示，与对照组相比，miR-21-3p的过表达显著抑制了IGFBP53’UTR的双荧光酶活比值（海肾酶活/萤火虫酶活，R/F）（P<0.05），抑制miR-21-3p的表达后，IGFBP53’UTR的双荧光素酶活性比值（R/F）显著增加（P<0.05）；进一步的RT-qPCR和Western blot结果发现，BMECs中miR-21-3p的过表达显著抑制了IGFBP5mRNA和蛋白的表达量（P<0.05），而抑制miR-21-3p的表达后，IGFBP5mRNA和蛋白的表达水平显著上调（P<0.05）。表明IGFBP5是miR-21-3p的一个靶基因。 3.RT-qPCR结果显示，过表达miR-21-3p显著抑制了NONBTAT017009.2的表达（P<0.05）。NONBTAT017009.2过表达载体转染BMECs后，MTT试验结果显示细胞活力显著下降（P<0.05）。RT-qPCR结果发现，NONBTAT017009.2的过表达显著上调了miR-21-3p靶基因IGFBP5的表达量，而miR-21-3p的表达被显著抑制（P<0.05）。进一步通过双荧光素酶试验分析发现，与对照组相比，过表达miR-21-3p后显著抑制了NONBTAT017009.2的双荧光酶活比值（R/F）（P<0.05）。以上结果表明，miR-21-3p与NONBTAT017009.2存在互作，NONBTAT017009.2可作为一个竞争性内源RNA(ceRNA)参与miR-21-3p的调控过程。 4.通过构建STAT3过表达载体和miR-21启动子区荧光素酶报告载体，双荧光素酶试验分析发现，STAT3的过表达显著抑制了miR-21启动子区的双荧光酶活比值（F/R）（P<0.05）。 本研究揭示了miR-21-3p在奶牛乳腺上皮细胞增殖中的作用，并通过建立一个NONBTAT017009.2-miR-21-3p-IGFBP5的调控关系和对相关转录因子的初步研究，共同阐述了miR-21-3p调控奶牛乳腺上皮细胞增殖的作用机制，为揭示奶牛乳腺发育和泌乳的周期性变化的分子机制提供理论依据。