骨重建的失衡是由于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的偶联被破坏,容易引起各类骨代谢异常疾病。越来越多的研究表明,低氧与骨质疏松的发生密切相关。我国有相当大一部分人居住在高原慢性低氧环境中,因此,研究低氧对骨代谢的影响有非常重要的意义。低氧是骨代谢的重要调节因子,HIF-1是诱导低氧基因和修复细胞内微环境的核心转录因子,能激活下游靶基因的转录,引发细胞对缺氧的一系列适应性反应。已证实,缺氧可导致HIF-1α大量聚集,进而激活破骨细胞活性,促进破骨细胞分化并增加骨吸收活性。RANKL是调节破骨细胞分化和功能的关键因素,由成骨细胞分泌,低氧或内源性过表达HIF-1α可促进RANKL的表达,与破骨细胞表面的RANK受体结合后,可诱导破骨细胞分化。红景天苷（Salidroside,SAL）是红景天中的主要活性成分,具有抗缺氧、抗癌、抗抑郁、保护中枢神经系统、保护心血管系统等药理活性。课题组前期工作证实,SAL在低氧条件下可通过激活成骨细胞HIF-1α/VEGF通路介导血管生成骨形成偶联,提高去卵巢大鼠的骨密度、骨生物力学及形态计量学指标。有关氧感应成骨细胞HIF-1α能否通过直接上调自身RANKL表达间接促进破骨细胞分化和功能,以及SAL对破骨细胞的作用是否也通过激活氧感应HIF-1信号通路影响破骨细胞的分化和功能,均未见报道。本研究在文献报道及前期工作基础上,利用小鼠破骨前体RAW264.7细胞、小鼠骨髓破骨前体细胞（BMMs）、人成骨样MG-63细胞、小鼠成骨样MC3T3-E1细胞模型,从细胞及分子水平研究HIF-1α对低氧诱导的成骨细胞RANKL表达中作用,及低氧下SAL对破骨细胞HIF-1α通路调控作用,为今后临床应用SAL防治骨质疏松症提供依据。方法:1选择人成骨样MG-63细胞和小鼠成骨样MC3T3-E1细胞作为研究模型,采用低氧（1%O₂）和模拟低氧（CoCl₂）两种方式处理细胞,实验分为三组:（1）对照组;（2）1%O₂组;（3）CoCl₂组（500μM）,运用q PCR和ELISA实验技术检测低氧对MG-63细胞和MC3T3-E1细胞RANKL基因和蛋白表达的影响。进一步应用HIF-1α抑制剂YC-1证实低氧对RANKL表达的上述作用是HIF-1α介导的,方法同上,不同之处在于低氧前先用YC-1（10μM）或DMSO预处理细胞1 h,同时设立YC-1对照组。2运用脂质体瞬时转染技术,将ss HIF-1α及其空载体p CMVh-HA或HIF-1αsh RNA及scramble sh RNA分别导入成骨细胞中,利用Western Blot、ELISA、q PCR技术检测内源性过表达和抑表达HIF-1α对成骨细胞RANKL基因和蛋白表达的影响。3运用脂质体法将pGL3-h RANKL promoter-luc质粒与ss HIF-1α或p CMVh-HA及SV40-βgal共转染至成骨细胞中,24 h后低氧作用24 h,应用荧光素酶报告基因技术检测HIF-1α对成骨细胞RANKL转录活性的影响。4运用ChIP技术确定低氧条件下HIF-1α能否与成骨细胞染色质中的RANKL启动基因结合。5利用CoCl₂低氧条件,实验分为六组:（1）对照组;（2）CoCl₂组（100μM）;（3）CoCl₂+SAL（1 n M）组;（4）CoCl₂+SAL（10 n M）组;（5）CoCl₂+SAL（100 n M）组;（6）CoCl₂+SAL（1000 n M）组;运用Western Blot、ELISA、q PCR技术,检测低氧下SAL对破骨前体细胞RAW264.7中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。6利用RANKL（50 ng/m L）和M-CSF（25 ng/m L）诱导RAW264.7细胞4天,将其诱导为成熟的破骨细胞,利用TRAP染色鉴定;运用同5中的条件和方法,检测低氧下SAL对经RANKL和M-CSF诱导的成熟破骨细胞RAW264.7中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。7选用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠,无菌条件下取双侧股骨骨髓,提取BMMs细胞,利用TRAP染色、细胞表面抗体检测鉴定原代破骨细胞的纯度;利用MTT与Western Blot技术,摸索相当于1%O₂时的CoCl₂浓度;并利用RANKL（50 ng/m L）和M-CSF（50 ng/m L）诱导原代破骨前体细胞4天,将其诱导为成熟的破骨细胞,运用同5中的条件和方法,检测低氧下SAL对BMMs细胞中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达的影响。8采用免疫荧光和Western Blot技术观察低氧下SAL对RAW264.7细胞中HIF-1α核转位的影响,以及脂质体瞬时转染技术,将mouse p GL3-4×HRE-luc质粒导入RAW264.7细胞中,运用荧光素酶报告基因技术检测低氧下SAL对RAW264.7细胞中HIF-1α转录活性的影响。9运用YC-1（10μM）对上述实验进行阻断,选取SAL作用最明显的浓度,实验分为五组:（1）对照组;（2）YC-1组;（3）CoCl₂组（100μM）;（4）CoCl₂+SAL组;（5）YC-1+CoCl₂+SAL组;探讨低氧下YC-1对SAL介导的RAW264.7细胞中HIF-1α、p VHL、VEGF、ANGPTL4、IL-6和mi R-20a基因和蛋白表达以及HIF-1α核转位和转录活性的影响。结果:1低氧（1%O₂）或模拟低氧（500μM CoCl₂）条件下,可使人成骨样MG-63细胞和小鼠成骨样MC3T3-E1细胞RANKL基因和蛋白表达水平显著升高,应用HIF-1α特异性阻断剂YC-1可阻断低氧对RANKL表达的调节作用。2内源性过表达HIF-1α可上调MG-63细胞RANKL基因和蛋白的表达,而抑制内源性HIF-1α表达则可下调RANKL基因和蛋白表达,提示低氧条件下氧感应成骨细胞也可能通过诱导HIF-1α直接上调自身RANKL表达从而间接促进破骨细胞分化。3低氧条件下,过表达HIF-1α可显著上调MG-63细胞RANKL基因启动子的转录活性。4低氧能促进HIF-1α与MG-63细胞染色质中的RANKL启动基因结合。5低氧条件下SAL对破骨前体细胞RAW264.7中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达起促进作用,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。6经TRAP检测,经RANKL和M-CSF诱导的RAW264.7细胞,分化为成熟的破骨细胞;低氧条件下SAL可促进经RANKL和M-CSF诱导的成熟破骨细胞RAW264.7中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。7经表面抗体的荧光检测、TRAP鉴定,证明所提取小鼠骨髓细胞为原代破骨前体细胞,纯度为97.9%;利用MTT与Western Blot技术,摸索出相当于1%O₂时的CoCl₂浓度为50μM;低氧条件下SAL可促进BMMs细胞中HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,而抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。与RAW264.7细胞的结果一致。8低氧条件下SAL可促进RAW264.7细胞中HIF-1α的核转位,胞浆胞核中HIF-1α的蛋白量均增加,其中胞核中的蛋白表达量显著升高;另外,低氧条件下SAL对HIF-1α的转录活性也具有促进作用。9应用HIF-1α特异性阻断剂YC-1能明显抑制低氧条件下SAL介导的HIF-1α及其下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6基因和蛋白的表达,并促进下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达;对低氧条件下SAL介导的HIF-1α的核转位和转录活性也具有抑制作用。结论:1 HIF-1α表达可上调成骨细胞RANKL的表达,HIF-1α是通过与RANKL分子的基因启动子结合来促进其转录进而上调其表达的。2低氧条件下,SAL可促进破骨细胞内HIF-1α信号通路中下游靶基因VEGF、ANGPTL4和IL-6的表达,抑制下游靶基因mi R-20a及上游调控基因p VHL的表达。3低氧条件下,SAL通过促进破骨细胞内HIF-1α的核转位及其转录活性,促进HIF-1α的表达。