新城疫是由新城疫病毒引起的鸡和火鸡的一种急性高度接触性传染病.20世纪40年代就开始使用新城疫疫苗,通常使用的疫苗为活病毒苗.但活疫苗会导致鸡群产生轻微呼吸道症状,从而继发细菌感染.这些疫苗产生的免疫反应持续时间短,必须进行多次免疫接种;且雏鸡具有较高的母源抗体,会干扰疫苗的免疫效果.因此,构建重组病毒来表达与新城疫病毒免疫有关的抗原基因,试图解决以上问题.马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的鸡的一种高度接触性传染性肿瘤病.马立克氏病病毒疫苗株被认为是最有潜力的病毒载体之一,通过构建表达外源基因抗原的多价活疫苗来诱导免疫达到预防禽病的目的.考虑多价重组疫苗的诸多优点,该试验利用马立克氏病病毒的gB启动子控制新城疫病毒F基因的表达来构建重组马立克氏病病毒,使其能有效地预防新城疫和由马立克氏病病毒超强毒株引起的马立克氏病,且既可以避免病毒对外源启动子的排斥作用,又可以避免母源抗体的影响来提高疫苗对商品鸡的免疫保护作用.根据GenBank己发表的新城疫病毒F48E9株F基因序列,设计了一对引物,以含有新城疫病毒F48E9株F基因的质粒pzl/z2为模板,将扩增的F基因(1 678bp)片段克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF.再根据GenBank己发表的载体pIRES基因序列,设计了一对引物,以载体pIRESF为模板将扩增的包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2 900bpDNA片段,再克隆入包含马立克氏病病毒的gB启动子的pBluescript Ⅱ SK载体中,并使其克隆到gB启动子580bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3 500bp克隆到马立克氏病病毒CVI988非必需区US10基因中,并命名为pUS10F.在试验中,我们选择CVI988疫苗株作为病毒载体来构建重组病毒,原因是致弱的MDVI型疫苗如CVI988,它们的免疫效果明显优于HVT,同时疫苗株MDVI型与vvMDV的抗原有较高的同源性,理论上可以比其他血清型更能诱导具有针对性的免疫应答反应,特别是针对vvMDV和vv+MDV.为进一步提高重组病毒的表达水平,将成功构建的转移质粒载体转染293T细胞后,对转染条件进行了优化,通过利用转染后293T细胞的基因组作为模板进行PCR,结果说明真核细胞中已有带F基因的细胞存在,质粒载体已经进入细胞DNA.间接免疫荧光检测结果表明,转染质粒载体后的293T细胞可特异性地表达NDV的F基因,所表达基因的抗原性较好,能够与抗DNV的标准血清反应.从而说明转移质粒载体中的基因表达盒可以在细胞中有效地表达,为进一步开发新型的抗ND和MD疫苗的研究打下基础.