研究背景:痛风(Gout)是一种尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病,与嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关。传统医药理论认为在内责之禀赋不足,过食膏粱厚味,在外责之风、寒、湿、热等外邪,多种病理产物瘀阻气血经脉,致关节红肿热痛,引起痛风。综上,中西医对痛风的认识均包含关节症状和体内代谢两方面,治疗亦针对这两方面进行。西药非留体类抗炎药、苯溴马隆、别嘌醇等抗痛风作用明确,但副反应较为严重。本文前期收集60余种复方、100余味中药均有显著治疗痛风病药效,功效涉及健脾利湿、行气活血、清热、祛风湿等。痛风的治疗及血尿酸的控制是一个长期过程,这可能引发一定安全问题。多名学者观察到部分用于痛风病治疗的中药成分、有效组分或复方汤剂,可能引起肝损伤,在治疗过程中带来不良反应风险,如皂苷类成分中的柴胡皂苷D、三七总皂苷,生物碱类成分中的汉防己甲素、吴茱萸碱、苦参碱、秋水仙碱、槟榔碱等,以及莪术、诃子、乳香的水提部位,吴茱萸的挥发油、水提、醇提部位等等。常用中药穿山龙、莪术、防己、诃子、龙胆、苦参等均有实验研究表明其可能导致动物的肝脏损害。再如复方常用药柴胡,其常用方大柴胡汤在应用过程中可能引起自身免疫性肝炎。痛风病的治疗疗程长,多联合用药,引发肝损伤的成分多为中药的有效成分或主要成分,更进一步加大了肝脏安全风险。因此开展对痛风治疗中药的肝损伤机制研究,能够防范不良反应的发生,尽量杜绝安全风险,起到安全预警作用。因此,本研究以用于痛风病治疗的中药为切入点,梳理其潜在肝损伤成分,发掘相关核心靶点、通路,探讨此类中药潜在肝损伤成分的作用机制,为痛风的安全合理用药提供参考,同时为中草药相关肝损伤的研究提供方法学参考。研究目的:1.采用文献挖掘、网络药理学、分子对接方法,筛选用治痛风病的中药中的潜在肝损伤成分、核心靶点、关键通路,为进一步探讨其作用机制奠定基础;2.基于筛选结果,采用分子生物学手段验证潜在肝损伤成分对核心靶点的作用,初步探讨用治痛风病的中药潜在肝损伤成分的作用机制,为防范此类中药的临床肝损伤作用提供实验依据。研究内容与方法:本文采用计算机模拟结合生物学方法,围绕用于痛风病治疗的中药中的潜在肝损伤成分的作用机制研究展开文献综述与实验研究。1.文献综述文献研究主要通过检索国内外研究文献,从中草药相关肝损伤的研究现状、计算机模拟方法在中药安全性研究中的应用、痛风治疗现状与中药的应用进展三方面内容,为用于痛风病治疗的中药的肝损伤机制的初步探索、整体实验设计提供理论和方法基础。2.实验研究实验研究主要分为两个章节。第一章 用于痛风病治疗的中药的肝损伤成分、靶点、通路挖掘1.首先通过检索各数据库文献,汇总相关实验研究、临床试验报道、个案报道等,梳理用于痛风病治疗的单味及复方中药。在此基础上检索中药的肝损伤相关报道,经全文阅读后,剔除功效研究、复方或成药的肝损伤报道、与肝损伤无关的其他不良反应报道,汇总用于痛风病治疗的中药的肝损伤表现及相关成分,筛选潜在肝损伤成分。2.采用网络药理学方法,建立成分相关蛋白-蛋白互作网络、肝损伤相关蛋白-蛋白互作网络,交互两种网络,构建“成分-靶点”网络图;对靶点进行Pathway分析,构建“靶点-通路”网络图。对以上网络图进行拓扑学分析,挖掘核心靶点、关键通路。为后续实验提供物质基础及考察位点;3.基于潜在肝损伤成分、核心靶点,采用分子对接方法,依据结合自由能对肝损伤成分进行打分,根据打分排序确定待考察的潜在肝损伤成分,同时观察成分与核心靶点的结合方式。通过第一章实验,获得用于痛风病治疗的中药171种,待考察潜在肝损伤成分6种(薯蓣皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷D、汉防己甲素、吴茱萸次碱、吴茱萸碱),核心靶点为p38α蛋白,关键通路为MAPK信号转导通路,为后续生物学实验提供研究基础。第二章 用于痛风病治疗的中药潜在肝损伤成分的毒性作用及机制探讨1.采用不同剂量潜在肝损伤成分干预人正常L-02肝细胞,筛选合适的给药浓度,观察培养液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力变化,考察p-p38α/p38α表达情况,初步探讨核心靶点p38α在肝细胞损伤过程中的作用;2.通过抑制剂SB203580干预成分诱导后的L-02细胞,观察相关酶活力变化,考察p-p38α/p38α表达变化,反证核心靶点p38α在肝细胞损伤过程中的作用。第二章实验结果表明,各潜在肝损伤成分可使细胞存活率下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力升高,p-p38/p38表达升高;抑制剂SB203580可部分纠正以上过程。本部分实验验证了计算机模拟结果,初步阐释用于痛风病治疗的中药中的潜在肝损伤成分通过活化核心靶点p38发挥作用的生物机制。研究结果:1.文献梳理用于痛风病治疗的复方69个,中药共171种。单味药发挥作用的中药7种,复方中发挥作用的中药134种,既有复方应用报道,又有单味应用报道的中药30种。功效方面,利水渗湿药20种,占自身中药数量的45.45%,消食药5种,占41.67%,祛风湿药19种,占39.58%,活血化瘀药18种,占34.62%,平肝息风药7种,占33.33%;在此基础上检索中药的肝损伤相关报道,共61236篇文献。全文阅读文献,剔除功效研究、复方或成药的肝损伤报道、与肝损伤无关的其他不良反应报道,共获得文献481篇,相关中药17种;收集同时具有药效及肝损伤报道的可疑成分,发掘潜在肝损伤成分32种。2.采用网络药理学方法,以度中心性、介度中心性、接近中心性筛选,挖掘到用于痛风病治疗的中药的肝损伤重要靶点153个,核心靶点4个,即MAPK14(p38)、NOS2、PPARG、TF。依据度中心性排序,p38蛋白排名第一,同时经文献检索认为它与NOS2、PPARG、TNF互为上下游,且可能对其他靶点存在调控关系,是更为关键的靶点蛋白。同时p38蛋白不同亚型的分布有所不同,p38αα在大多数细胞类型中表达,p38β主要分布于脑组织中,p38y主要分布于骨骼肌,p38δ主要分布于睾丸,胰腺,肾和小肠。因此后续实验重点考察p38α蛋白。根据p值筛选关键通路,涉及病毒、癌症、MAPK信号通路等。MAPK信号通路排序较为靠前,结合核心靶点筛选结果,以其为本研究的肝损伤关键通路。病毒、癌症相关通路与本研究目的不符,故后续不做讨论。3.采用分子对接方法,以p38蛋白为受体,以32种潜在肝损伤成分为配体进行半柔性对接,获得结合自由能打分及排序。后续重点考察得分排名前六的潜在肝损伤成分,即薯蓣皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷D、汉防己甲素、吴茱萸次碱、吴茱萸碱。4.采用人正常L-02肝细胞,考察潜在肝损伤成分的毒性作用及机制,结果表明,薯蓣皂苷、黄芩苷、汉防己甲素、吴茱萸次碱、吴茱萸碱可使细胞培养液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力不同程度升高,薯蓣皂苷、黄芩苷、汉防己甲素、吴茱萸碱可使p-p38/p38表达升高;抑制剂SB203580干预后,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力不同程度降低,p-p38/p38表达有所降低。柴胡皂苷D诱导p-p38/p38变化不明显,可能存在其他机制。研究结论:用于痛风病治疗的中药中的薯蓣皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷D、汉防己甲素、吴茱萸次碱、吴茱萸碱成分,可引起L-02细胞存活率下降,细胞培养液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力不同程度升高,p-p38/p38表达增加;且p38蛋白抑制剂可部分纠正以上过程。提示抗痛风中药潜在肝损伤成分活化p38蛋白导致肝细胞损伤可能是其作用机制之一。