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目的通过对比原发性肝癌原发灶与门静脉癌栓样本的基因差异,筛选出癌栓中高表达的特异性基因,利用RNA干扰、CCK8、Transwell等技术进一步探讨筛选出的目的基因的生物学功能和在肝癌进展、转移中的作用机制。方法结合临床,利用早期收集的10例原发性肝癌伴门静脉癌栓样本,通过Illumina高通量测序技术,筛选出门静脉癌栓较原发灶中表达明显上调的基因,运用NCBI BLAST对比结果报告分析系统,根据Score、E Value、Identities等挑选出最具特异性的目的基因FLJ37396和TTC6。通过QPCR技术检测正常细胞L-O2（NC）和普通肝癌细胞hep G2、三株高转移潜能的肝癌细胞huh7、MHCC97H、HCCLM3共五组细胞中两种目的基因的表达情况,分别设计合成靶基因的干扰RNA,转染至五组细胞样本,再用QPCR技术检测转染后细胞样本中靶基因的表达量,用CCK8检测细胞增殖情况,用Transwell检测细胞的迁移、侵袭情况,并与转染前作对比分析。结果1、10例肝癌伴门静脉癌栓样本经Illumina测序,筛选出10个在癌栓中表达较原发灶明显上调的特异性基因,其转录本ID分别是Novel Tr536、Novel Tr150、Novel Tr1258、Novel Tr1259、Novel Tr1257、Novel Tr298、Novel Tr574、Novel Tr590、Novel Tr213、Novel Tr1266。2、10个转录本分别通过NCBI BLAST对比结果报告分析系统比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGETYPE=Blast Se arch&LINKLOC=blasthome）,转录本对应所翻译的蛋白质名称分别为:（1）Novel Tr536 Transmembrane protein FLJ37396 isoform X11（2）Novel Tr150 Homo sapiens uncharacterized LOC105369364（LOC105369364）（3）Novel Tr1258 Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like（LOC101059915）（4）Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like（LOC101059915）（5）Novel Tr1257 Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like（LOC101059915）（6）Novel Tr298 Homo sapiens neurofibromin 1（NF1）（7）Novel Tr574 Homo sapiens gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1（GABBR1）（8）Novel Tr590 Homo sapiens chromosome 3,GRCh38.p7 Primary Assembly（9）Novel Tr213 Homo sapiens tetratricopeptide repeat domain 6（TTC6）（10）Novel Tr1266 Homo sapiens glycerol kinase（GK）。3、根据转录本的编码能力分值（大于9.5）、长度（1000-2500bp）、翻译产物等条件筛选,排除NovelTr150（非编码转录本）、NovelTr1258（长度4476bp）、NovelTr1259（长度4204bp）、NovelTr1257（长度4721bp）、NovelTr590（长度8031）、NovelTr298（翻译产物为神经纤维瘤相关蛋白）、NovelTr574（翻译产物为γ-氨基丁酸B1型受体）、NovelTr1266（翻译产物为甘油激酶）。NovelTr536编码能力分值14.09,长度1567bp,翻译产物跨膜蛋白FLJ37396,NovelTr214编码能力分值9.65,长度1057bp,翻译产物TTC6。两者均符合条件,并具有未明确的生物学功能,且存在潜在影响细胞增殖、迁移、侵袭的能力,因此选取二者作进一步实验探讨。4、对L-O2、hep G2、huh7、MHCC97H、HCCLM3五组细胞样本进行QPCR检测,设定正常肝细胞组L-O2中基因FLJ37396表达量为1,则肝癌细胞组hep G2表达量为1.74,高转移潜能的肝癌细胞huh7、MHCC97H、HCCLM3表达量分别为55.38、9.32、4.31;设定正常肝细胞组L-O2中基因TTC6表达量为1,则hep G2中表达量为1.36,而huh7、MHCC97H、HCCLM3中表达量分别为36.43、5.11、3.85。两者表达量均在huh7细胞株中升高最为明显,因此选取huh7细胞株进行后续RNA干扰实验。5、对NC细胞、空细胞huh7、三株转染后huh7细胞组si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3共五组细胞样本进行QPCR检测,并设定NC细胞对照组中基因FLJ37396表达量为1,则空细胞对照组中目的基因表达量为1.04,三株转染si RNA细胞实验组si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3目的基因表达量分别为1.92、0.35、0.043。根据转染后基因表达量的结果说明,si RNA-1组目的基因表达量较转染前明显升高,干扰效果不理想,考虑靶点1未能有效敲减目的基因表达,可能与靶点1处于非编码区或si RNA-1设计不佳等相关;而si RNA-2、si RNA-3两组目的基因表达量均较转染前明显下降,分别为转染前0.35倍和0.043倍,达到预期干扰效果,其中靶点3干扰效果最佳,可以有效地敲减huh7细胞中FLJ37396的表达,效率达95%以上,因此选取靶点3进行后续对比实验。6、对NC细胞、空细胞huh7、三株转染后huh7细胞组si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3共五组细胞样本进行QPCR检测,设定NC细胞对照组中基因TTC6表达量为1,则空细胞对照组目的基因表达量为0.65,三株转染si RNA细胞实验组si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3目的基因表达量分别为1.29、0.12、1.23。根据转染后基因表达量的结果可以说明,si RNA-1、si RNA-3两组目的基因表达量较转染前稍有升高,干扰效果不理想,靶点1和靶点3未能有效敲减目的基因表达,可能与靶点处于非编码区或si RNA设计不佳等相关;而si RNA-2组目的基因表达量较转染前明显下降,为转染前0.12倍,可以有效地敲减huh7细胞中TTC6的表达,效率达85%以上,因此选取靶点2进行后续对比实验。7、对照组huh7和三组转染实验组si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6分别进行CCK-8实验,酶标仪读取待测样品和空白对照在450nm处的OD值。第一天,空白对照组、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分别是0.147、0.133、0.142、0.145,第二天各组OD值分别是0.434、0.391、0.487、0.280,第三天各组的OD值分别是0.630、0.602、0.733、0.434。根据OD值结果显示,干扰基因TTC6的表达明显抑制了huh7细胞的增殖,而干扰基因FLJ37396的表达反而促进huh7细胞的增殖。8、对照组huh7和三组转染实验组si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6分别进行Transwell迁移和侵袭实验,酶标仪读取待测样品和空白对照在570nm处的吸光值,然后根据OD值计算细胞的迁移和侵袭能力。Transwell迁移实验中,空白对照组、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分别是0.260、0.235、0.173、0.153;Transwell侵袭实验中,空白对照组、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分别是0.221、0.206、0.170、0.151。根据OD值结果显示,干扰基因TTC6的表达抑制了huh7细胞的迁移和侵袭,干扰基因FLJ37396的表达同样能抑制huh7细胞的迁移和侵袭。结论1、根据10例临床肝癌伴门静脉癌栓样本筛选出10个在癌栓中表达较原发灶明显上调的特异性基因,其中2个基因的转录本NovelTr536、NovelTr214编码能力分值较高,长度适中,翻译蛋白产物FLJ37396、TTC6具有未明确的生物学功能,且存在潜在影响细胞增殖、迁移、侵袭的能力,具有较高的深入研究价值。2、FLJ37396是一种跨膜蛋白,其中多种FLJ结构蛋白已证实对不同肿瘤细胞的生长有影响,因此推断FLJ37396很可能与肝癌的转移等相关,但该蛋白的编码序列在官方没有明确的信息,即编码的蛋白在人的转录基因组中没有存在定论,也就是说现在还没有确认此基因编码的蛋白在人基因组中的完整序列。3、TTC6即三四氨基酸重复域6基序,包含TPR结构,TPR结构域是一种独特的、完全由螺旋结构组成的结构域。在高等生物基因组中,TPR结构蛋白是蛋白与蛋白间相互作用的常见媒介,是一类重要的分子伴侣。另外,热休克蛋白（heat shock protein）是另一类重要的分子伴侣,大量研究表明TPR蛋白能与HSP70/90等热休克蛋白结合,调节蛋白质构象、活性、胞内定位、水解等涉及细胞生长、分化的过程,从而实现对细胞周期、细胞凋亡、细胞活力的影响,因此TTC6很可能与肝癌的发展、转移相关联。4、根据五组细胞样本QPCR检测实验结果显示,FLJ37396和TTC6在普通肝癌细胞组hep G2中的表达量相对正常肝细胞组L-O2的表达量相差不大,而在MHCC97H,huh7以及HCCLM3三株高转移潜能的肝癌细胞株中的表达量有显著升高,提示FLJ37396和TTC6可能与肝癌的进展、转移以及门静脉癌栓的形成呈正相关。5、Huh7细胞在不同的si RNA终浓度条件下转染率各有不同,经不同浓度转染探索后,得出转染效率最高的终浓度为30n M,转染率达95%以上。6、基因FLJ37396和TTC6分别有多个不同的RNA干扰靶点,两者均能找到有效干扰靶点,经干扰后基因表达量敲减均达90%以上;另一方面,部分靶点经干扰后基因表达量反而明显增加,可能与靶点处于非编码区或si RNA-1设计不佳等相关。这表明RNA干扰的多变性和基因沉默机制的复杂性。7、CCK-8实验结果显示,干扰基因TTC6的表达明显抑制huh7细胞的增殖,这进一步表明基因TTC6能促进肝癌细胞的增殖;而干扰基因FLJ37396的表达反而促进huh7细胞的增殖,因此基因FLJ37396可能抑制肝癌细胞的增殖,也可能通过其他途径增强肝癌细胞的转移、侵袭能力。8、Transwell迁移实验和侵袭实验结果显示,干扰基因TTC6和基因FLJ37396均能抑制huh7细胞的迁移和侵袭,这进一步表明了两个靶基因促进了肝癌细胞的转移、侵袭能力。总之,本实验收集了10个门静脉癌栓及肝细胞癌原发灶临床标本,采用Illumina高通量测序技术,筛选出了癌栓较肝癌中10个明显上调的基因,根据NCBI的BLAST系统,挑选出了其中两个符合相关要求的特异性基因FLJ37396和TTC6。通过QPCR,检测正常肝细胞、肝癌细胞、包括huh7在内的三株高转移潜能的肝癌细胞中的两种基因表达,结果均在huh7细胞中表达最高。以huh7细胞为载体,通过si RNA分别沉默两种基因以干扰它们的表达,并通过CCK-8实验检测基因沉默细胞的增殖、Transwell实验检测该细胞的迁移和侵袭能力。结果证明,基因TTC6能促进肝癌细胞的增殖、TTC6和FLJ37396能促进肝癌细胞的迁移和侵袭。提示,此两种基因与肝癌转移有关,抑制相应基因或蛋白表达可能为肝癌转移的有效防治提供新的靶点。