【背景】骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常见的原发性恶性骨肿瘤,其复发和转移是OS治疗的难点。因此,明确OS发展和转移所涉及的分子机制并发现新的治疗靶点来减少OS的复发和转移,从而提高患者生存率的重要性不言而喻。α-辅肌动蛋白-4(ACTN4)是肌动蛋白结合蛋白,属于血影蛋白超家族。本课题组前期研究发现,骨肉瘤转移率高的病例ACTN4的表达量明显增高。因此本研究以ACTN4基因展开进一步研究,探讨其在骨肉瘤中的作用及可能机制。核因子-κB(NF-κB)是一种蛋白质复合物,由多种亚基组合形成具有不同功能的异二聚体。其中P50/65异二聚体分布最广,磷酸化后P65与P50结合形成异二聚体,并转移至细胞核以启动下游基因转录。研究表明,异常激活的P65可导致肿瘤的发展,并且ACTN4与P65存在免疫共沉淀现象,因此有理由怀疑ACTN4与P65存在一定的联系。本研究将进一步探讨NF-κB信号通路在ACTN4影响OS发展中的作用。【目的】探讨ACTN4对骨肉瘤生长、迁移、侵袭及转移的影响,并进一步探讨其可能的分子机制,为发现新的治疗靶点、减少OS的复发和转移提供理论依据。【方法】通过RT-q PCR对20对骨肉瘤及癌旁组织ACTN4的m RNA表达差异进行分析;选取两种骨肉瘤细胞,通过慢病毒介导稳定转染骨肉瘤细胞株来上调或下调骨肉瘤细胞ACTN4的表达水平;将转染后的细胞分成四组:沉默组、对照一、过表达组、对照二;通过CCK8与EDU试剂盒检测ACTN4的表达变化对骨肉瘤细胞增殖能力的影响;采用划痕实验检测ACTN4的表达变化对骨肉瘤细胞迁移能力的影响;通过Transwell小室法分析ACTN4的表达变化对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。进一步通过裸鼠腿部注射骨肉瘤细胞制作移植瘤模型,并通过免疫荧光实验验证植瘤后裸鼠体内骨肉瘤细胞ACTN4的表达水平;再通过对腿部移植瘤大小的观察、测量探讨ACTN4表达变化对骨肉瘤生长的影响;6周后取下裸鼠肺组织进行切片、HE染色,通过观察肺部转移结节的大小和数目判断ACTN4对骨肉瘤肺转移的影响。此外,本研究还利用Western Blot实验Transwell实验分析NF-κB在ACTN4影响骨肉瘤发展中的作用。【结果】RT-q PCR结果表明骨肉瘤组织中ACTN4的m RNA表达量明显高于癌旁组织;增殖实验结果表明ACTN4基因沉默组的细胞增殖能力较对照组减低;迁移实验表明沉默组细胞划痕迁移速度较对照组慢;侵袭实验中沉默组穿膜细胞数明显少于对照组;反之,过表达ACTN4基因表达水平可以得到相反结果。在裸鼠体内,沉默组裸鼠腿部的移植瘤生长较对照组慢;肺部转移结节数目和大小较对照组小;反之,过表达ACTN4可以得到相反结果。在机制研究中,过表达ACTN4可以增强骨肉瘤细胞的侵袭能力,而沉默P65的表达可以逆转该促进作用。【结论】体外实验证实ACTN4可以促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力;裸鼠体内移植瘤模型证实ACTN4对骨肉瘤生长、转移有促进作用。ACTN4可能通过NF-κB信号通路增强骨肉瘤的侵袭能力从而促进骨肉瘤的发展。