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构象病是由于蛋白质错误折叠引起的一种疾病,其典型特征为具有正常功能的蛋白质构型发生非正常变化,引起错误折叠,导致蛋白质从正常形态逐渐变为富含大量β折叠结构的淀粉样斑块,沉积在组织器官中,从而使细胞功能衰退直至凋亡。2型糖尿病作为一种常见的构象病,由于它患病人数逐年增加,已经成为一种严重危害人类生活质量和身体健康的流行性疾病。胰岛淀粉样多肽的纤维化沉积被认为是2型糖尿病的主要病理特征之一。虽然口服降糖药以及直接注射胰岛素均可用于治疗2型糖尿病,但是此种干预性治疗只能初步改善和维持正常血糖值,在治疗后期,随着并发症逐渐发生,此种治疗方法具有一定局限性。胰岛淀粉样多肽聚集形成的淀粉样纤维能够破坏胰岛β细胞膜,导致β细胞逐渐凋亡,加剧了2型糖尿病的病症。抑制胰岛淀粉样多肽的聚集能够减缓2型糖尿病的病发,因此研发抑制胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂为2型糖尿病的治疗提供了一种新方法。人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）的不同片段具有不同性质,阻断hIAPP自身π-π堆积作用,可以有效减弱hIAPP成淀粉样纤维的能力。因此本论文针对人胰岛淀粉样多肽自聚集行为进行了研究并设计合成了多种多肽类抑制剂。首先,本研究以牛血清白蛋白（BSA）为模版蛋白,运用微量热泳动技术（MST）建立了一种能够研究蛋白聚集行为的方法,考察了人胰岛淀粉样多肽片段11-20(hIAPP11-20)在不同溶液中聚集行为,最终以hIAPP11-20为目标物,设计并合成了一系列具有不同构型的多肽,考察了它们对hIAPP11-20淀粉样纤维形成的抑制效果,探讨了影响hIAPP11-20淀粉样纤维形成的主要因素。具体研究内容如下:1.运用微量热泳动技术建立研究蛋白聚集行为的方法在药物研发过程中,探究蛋白与其目标分子的结合行为为药物分子设计提供了大量的基本信息。本实验以牛血清白蛋白（BSA）为模板蛋白,分别运用微量热泳动技术（MST）和普通荧光猝灭方法,考察了BSA与一种常见小分子异硫氰酸钠（FITC）之间的相互作用。MST实验表明,在短时间内,BSA与FITC发生了两种形式的相互作用。在MST竞争实验中,以华法林和布洛芬分别为BSA不同位点的特异性结合标记物,结果表明,FITC主要与BSA的位点II位结合,但也与位点I位有少量结合,同时也证明了FITC并不以标记的形式与BSA发生相互作用,而是与BSA聚集体发生结合,从而表现出2种结合方式。MST实验所得的结果与荧光实验结果相一致,进一步表明MST在研究生物分子间相互作用中的可靠性。因此,MST不仅可以为生物分子间相互作用提供大量有用的信息,也可以研究蛋白聚集行为,获得其它方法不能得到的信息。2.hIAPP11-20在不同溶液中的聚集行为研究hIAPP11-20能够在体外形成与全长类似的富含β折叠的淀粉样纤维,因此选择hIAPP11-20作为探究淀粉样多肽聚集行为的目标物。本实验运用MST技术和传统的Th T荧光法,考察了hIAPP11-20在不同溶液（Tris-HCl,HEPES,PBS和超纯水）中的淀粉样纤维的形成过程。实验结果表明,hIAPP11-20在不同溶液中表现出不同的聚集行为,hIAPP11-20不仅与自身发生相互作用,也可能与溶质分子发生结合,说明缓冲溶液不仅只是起到维持溶液环境稳定的作用,还有可能参与目标分子的相互作用。hIAPP11-20与Tris的亲和力远大于hIAPP11-20与其它溶质分子的亲和力,说明hIAPP11-20在Tris-HCl缓冲溶液中自聚能力要远小于hIAPP11-20在其它溶液中的自聚能力。在HEPES和超纯水中,hIAPP11-20表现出相似的自聚集行为。PBS缓冲溶液中带负电的磷酸根离子可能会“中和”一部分hIAPP11-20自身的正电,从而导致hIAPP11-20在PBS中快速形成淀粉样纤维聚集。因此,在研究hIAPP11-20淀粉样纤维化过程时,缓冲溶液的影响需考虑在内。同时,MST技术也为研究多肽或蛋白的早期聚集行为提供了一种简单有效的方法。3.新型阻断肽抑制hIAPP11-20聚集效果的研究hIAPP错误折叠所产生的淀粉样纤维是2型糖尿病的一种重要病理特征。本实验设计并合成了17条具有不同长度,构型以及组成的多肽类抑制剂,以hIAPP11-20为模板,考察了它们抑制hIAPP11-20淀粉样纤维形成的效果。通过MST实验以及Th T荧光实验深入探究了这些多肽抑制hIAPP11-20淀粉样纤维形成的机理,并用TEM表征了hIAPP11-20最终形成淀粉样纤维的形貌。结果表明短肽AT、SA、RF、KS、KT和KN,以及环肽cyclic-KS、cyclic-KT和cyclic-KN能够有效抑制hIAPP11-20淀粉样纤维的形成。其中,芳香型氨基酸的种类,多肽氨基酸的特定组成以及多肽的构型在抑制淀粉样纤维形成中起重要作用。MST实验量化了hIAPP11-20与多肽之间的亲和力,表明具有较高亲和力的多肽在抑制聚集中表现出良好的抑制效果,该结果与Th T荧光实验以及分子对接结果相一致。因此,MST是一种简单快速的方法,可用于初步筛选聚集抑制剂。本研究也为以后设计多肽抑制剂提供了一些实验基础,同时也为探究其他蛋白构象病的抑制剂扩展了思路。4.脂肽抑制hIAPP11-20聚集效果的研究根据有些脂肽能够保护细胞免受淀粉样纤维破环,而且脂肽与报道的抑制剂均含有较多的疏水基团等特点,本实验设计了一系列新型脂肽,以hIAPP11-20为探究淀粉样多肽聚集的目标物,考察了这些脂肽抑制hIAPP11-20淀粉样纤维形成的效果。我们通过MST、Th T荧光实验深入讨论了这些脂肽抑制聚集的机理,同时利用TEM表征了hIAPP11-20最终形成淀粉样纤维的形貌及hIAPP11-20与脂肽共同孵育后的hIAPP11-20聚集形貌。结果表明,随着脂肽链长的逐渐增加,其抑制hIAPP11-20聚集的效果逐渐增强。另外,含正电氨基酸的数量也在抑制hIAPP11-20淀粉样纤维形成中起到一定作用。因此,本实验拓宽了hIAPP淀粉样纤维化抑制剂的研究范围。本论文通过运用MST建立了一种能够研究蛋白聚集行为的方法,并采用该方法联合使用其他技术考察了hIAPP11-20在不同溶液中的自聚集行为,探讨了不同类型抑制剂的抑制hIAPP11-20聚集的效果,总结出影响hIAPP11-20淀粉样纤维化的因素,