白色念珠菌是一种重要的条件致病真菌,可引起机体不同程度的感染:从皮肤的浅表感染到危及生命的系统性感染。由于治疗手段的匮乏,其致死率高达81%。目前,临床上常规的治疗方法为抗真菌药物治疗,但是由于真菌的耐药性,药物不良反应,副作用的发生以及高额的治疗费用,使得念珠菌感染的致死率居高不下。因此,探索一条治疗白色念珠菌感染的新途径已经迫在眉睫。丝状噬菌体是一种可进行修饰改造的生物分子,其外部有外壳蛋白包裹。与传统的治疗药物相比,噬菌体的纳米级结构和优良的生物性能使其在生物制药领域发挥重要的作用。目前,噬菌体展示技术是一种筛选和产生单克隆抗体的有效方法。噬菌体pⅢ蛋白有3-5个拷贝,表达在噬菌体端部,在其顶端可融合表达单链抗体。通过这种方式表达的单链抗体,可用来进行与抗原高亲和力的筛选。本论文主要开展了如下两方面的研究工作:1.抗体治疗目前,有文献报道抗体可作为一种治疗白色念珠菌在内的多种真菌感染的重要治疗手段。尤其是当抗体靶向结合一些毒性分子,如分泌蛋白酶、与细胞多态性相关的表面抗原等,可产生有效的治疗效果。分泌型天冬氨酸蛋白酶(Saps)是白色念珠菌的一种重要毒理分子家族,其中Sap2的表达量最高。因此抗Sap2的抗体会产生一定的抗真菌作用。在本研究中,我们通过筛选人源噬菌体单链抗体展示文库获得了两种针对Sap2的噬菌体单链抗体,同时利用小鼠白色念珠菌感染模型对其潜在的治疗作用进行了评价,通过小鼠的致死率、真菌定植量和肾脏组织切片观察其治疗效果。实验结果表明,经过噬菌体单链抗体治疗之后,与对照组相比,小鼠的存活率显著提高,且真菌和炎性病灶的数量显著降低。为了探究抗体引起的机体免疫应答情况,我们检测了Th1、Th2和Th17三种细胞因子的表达水平。当小鼠注射噬菌体单链抗体后,其Th1和Th17细胞因子水平显著上调,由此推测抗体可能是通过激起机体产生细胞免疫应答,进而提高了小鼠对白色念珠菌感染的抵抗能力。2.光动力治疗近年来,光动力治疗(PDT)成为一种新型的治疗真菌感染的方式,主要包括光源和光敏剂两个要素。脱镁叶绿酸a(PPa)是一种叶绿素类型光敏剂,可在光照后诱导细胞凋亡。在本研究中,我们通过筛选人源噬菌体单链抗体展示文库获得了一条与白色念珠菌细胞壁蛋白MP65有高亲和力的噬菌体单链抗体。将这种噬菌体与PPa偶联,形成一种纳米尺寸的生物材料PPa-phage,同时又具有靶向性结合白色念珠菌和光动力性能。在经过PPa-phage光动力治疗后,白色念珠菌的生长受到抑制,同时也引发了细胞凋亡。扫描电镜结果显示白色念珠菌的结构受到破坏,细胞皱缩,内容物外泄。此外,我们进一步对其抗真菌机制进行了探究,发现白色念珠菌的线粒体膜电位明显下降,活性氧大量积累。另外,PPa-phage也引起了细胞周期的S期阻滞。最后,由于PPa-phage导致线粒体功能损伤,激活了metacaspase途径,进一步证明白色念珠菌是通过caspase依赖的凋亡途径从而发生细胞凋亡的。由此可见,本实验筛选得到的噬菌体单链抗体结合了噬菌体和单链抗体两者的优点,有可能为系统性白色念珠菌感染治疗开辟一条新的途径。另外,PPa-phage将光敏剂的光动力性能和噬菌体单链抗体的靶向性结合在一起,提高了这种双功能的纳米材料的抗真菌能力,拓宽了纳米材料的应用范围。