论文部分内容阅读
骨缺损修复是临床的难点和热点之一，牙槽骨缺损是颌面骨缺损中最为常见的一种，也是口腔义齿修复过程中棘手的问题。传统的治疗的方法，如骨移植、引导性组织再生技术和骨组织工程都有其自身的局限性，临床适用性不强。为了寻找更好的治疗方法，着眼于骨修复的整个生理过程，其包括细胞的迁移，血管的生成和骨的改建，同时也包括细胞生长因子对细胞的分化，增殖的调控，以及细胞生长因子的骨诱导、分子信号传导作用等。目前研究表明在骨修复过程中，大量局部和全身系统的调节因子，包括生长和分化因子，激素，细胞外基质，互相影响，通过循环系统募集到缺损部位，调节和加速骨缺损修复。因此，从分子水平出发，寻找到有效促进牙槽骨缺损修复的治疗方法，在口腔医学领域具有深远的理论意义和广泛的临床应用价值。β转化生长因子（Transforming growth factor-β，TGF-β）是一种作用广泛的细胞因子。大量研究证明，TGF-β可通过促进新生血管形成、刺激骨及软骨细胞的增殖分化及调节其他生长因子的功能等多种途径来促进牙槽骨的再生。β转化生长因子受体（Transforming growth factor-βreceptors，TGFβRs）为TGF-β的受体，是其发挥各种生物学作用的基础。其中，β转化生长因子受体-Ⅱ（Transforming growth factor-βreceptor Ⅱ，TGFβⅡ）是TGF-β的高亲和力受体之一，在促进成骨细胞增殖和分化过程中起重要作用。目的：本项目选择调控牙槽骨修复再生的关键基因--β转化生长因子受体Ⅱ（TGFβⅡ）作为靶向，以TGFβⅡ启动子为靶点，构建TGFβⅡ启动子荧光素酶报告基因的重组质粒，以为进一步筛选促进牙槽骨修复再生的药物研究提供基础，指导临床牙槽骨再生的药物治疗，具有重要的理论意义和实际应用价值。方法：通过NCBI数据库查找TGFβⅡ启动子序列，应用primer5.0引物设计软件设计TGFβⅡ启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR。得到的片段与pGEM-T Easy载体连接，将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性质粒进行培养、提取、酶切鉴定及测序。然后，将pGEMT-TGFβⅡp重组质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接，同样进行转化、培养和提取，并行酶切鉴定，成功构建pGL2-TGFβⅡp重组质粒。结果：通过PCR方法扩增出人类TGFβⅡ启动子序列，测序比对后发现仅有一个位点突变，考虑为点突变或者作为模板的基因组该位点本身突变，成功构建pGL2-TGFβⅡp重组质粒。结论：1.成功克隆出人类TGFβⅡ启动子序列；2.成功构建pGL2-TGFβⅡ启动子荧光素酶报告基因重组质粒。为临床促进牙槽骨缺损修复再生治疗提供分子靶点，并为指导临床合理用药及后续药物筛选研究奠定了基础。