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目的研究载异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨在兔脊柱结核模型体内的药物缓释性能。应用硬组织切片、天青-亚甲基蓝染色(Azure-methylene blue staining,AM染色)、透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)等技术,从形态学观察该纳米骨材料在病灶局部椎体骨组织中的分布及其与局部抗结核治疗疗效的相关性。方法选取新西兰大白兔85只,雌雄不限,体重2.5±0.3Kg,分笼标准饲料喂养。随机选取新西兰大白兔70只用结核分枝杆菌H37Rv标准株构建L4-5椎体脊柱结核模型,2周后经X线片、CT检查筛选病椎骨有骨破坏、死骨及空洞形成的实验兔为成功模型。分别随机选取30只模型兔作为实验组和对照组;随机选取10只正常兔作为空白对照组。行病灶清除术后,在骨缺损处植入载异烟肼、利福平的羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨的模型兔为实验组(纳米药组);对照组(非纳米药组)和空白对照组植入非载药羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨。于术后24h、72h、1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周处死纳米药组和非纳米药组实验兔,每次处死各3只,应用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测植入人工纳米骨后兔病椎的椎体骨、椎旁组织及下腔静脉血液中的药物浓度。于术后2周、4周、8周、12周取选取空白对照组兔模型取材,每个时相点随机处死2只,切取植骨边缘的椎体骨。将三组兔模型植骨界面处椎骨做硬组织切片、天青-亚甲基蓝染色及透射电镜,观察缓释纳米微粒在病灶局部的分布及局部的形态学特征。结果成功构建纳米药组、非纳米药组实验兔各30只,空白对照组实验兔10只,其余存活实验兔备用。非纳米药组实验兔构建脊柱结核模型术中死亡2只,空白对照组、纳米药组兔植骨术中各死亡1只,考虑脂肪栓塞或麻药过量所致;1只非纳米组兔植骨术后9周因不进食水死亡,均及时予以补充。非纳米药组2只实验兔于术后4周时左下肢出现截瘫症状,术后8周,1只实验兔腰部术区皮下出现波动感。余实验兔术后活动,精神及进食良好,伤口正常愈合。人工纳米骨释药实验:INH在模型兔病灶椎体骨中的各时相点药物浓度分别为75.66±1.95μg/g、48.46±2.34μg/g、30.69±2.74μg/g、20.34±1.63μg/g、9.36±1.17μg/g、5.19±1.40μg/g、2.73±1.19μg/g,至第10周后各时相点未检出药物浓度。椎旁肌肉组织中的各时相点浓度依次为39.51±2.25μg/g、23.65±1.55μg/g、16.39±2.10μg/g、10.38±1.44μg/g、3.66±0.79μg/g、1.89±0.73μg/g、0.26±0.10μg/g,同样在第10周后各时相点未检出药物浓度。INH在下腔静脉血中的药物浓度分别为0.63±0.05μg/g、0.28±0.03μg/g、0.12±0.01μg/g,2周后未检测出药物浓度。INH在相同时相点中病椎骨、椎旁肌中的药物浓度相近(P>0.05);而下腔静脉血中INH浓度则明显低前者(P<0.05);RFP在模型兔病灶椎体骨组织中的药物浓度分别为10.85±2.45μg/g、22.47±1.94μg/g、38.32±1.73μg/g、24.22±1.45μg/g、17.85±1.50μg/g、9.81±1.30μg/g、6.35±1.30μg/g、5.11±0.53μg/g、1.32±0.33μg/g。RFP在椎旁肌各时相点药物浓度分别5.39±1.50μg/g、20.66±1.29μg/g、48.72±2.24μg/g、32.27±1.63μg/g、15.58±1.88μg/g、8.69±0.79μg/g、3.43±0.39μg/g,在第10周后未检测到药物浓度。RFP在下腔静脉血中的药物浓度分别0.75±0.09μg/g、1.38±0.23μg/g、0.59±0.04μg/g、0.15±0.03μg/g,第4周后未检测出药物浓度。RFP在相同时相点中病椎骨、椎旁肌中的药物浓度相近(P>0.05);而下腔静脉血中RFP浓度则明显低于前者(P<0.05)实物图片和AM染色图片:纳米药组骨质损伤较重,骨质内小空泡样改变并散布较多炎性细胞;非纳米药组结核病灶区有死骨流出,纳米骨植骨融合界面形成致密硬化壁,致密硬化壁内正常骨结构改变,骨小梁增粗、增厚,间隙消失并形成致密的分层板状结构,哈弗氏系统消失;空白对照组骨组织损伤较轻,少量炎性细胞散在骨组织中。透射电镜实验:人工纳米骨材料植入后2周:各组动物体内的载药与非载药羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨均以胞吞方式进入受损骨细胞内,被溶酶体包裹。其中实验组载药纳米骨微粒于4周时已明显分解,8周时纳米微粒已大部分分解完毕,植入后12周后植骨材料已完全消失,受损骨细胞修复良好,并吸收纳米微粒,骨细胞形态、结构恢复正常。对照组植入非载药羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨材料4周时纳米微粒分解缓慢、8周时纳米微粒分解过程停滞,12周后,骨细胞核固缩,骨细胞凋亡,纳米微粒残存于骨细胞胞质内。空白对照组植入非载药羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨后,骨细胞在各个时相点均未见明显凋亡,纳米微粒被分解,骨细胞形态、结构正常。结论载异烟肼、利福平羟基磷灰石-硫酸钙纳米骨在兔脊柱结核模型病灶中可持续、长效的释放抗结核药物,局部药物浓度及持续时间均高于血液中的药物浓度和持续时间。经AM染色、电镜技术等微观层面的研究证实该纳米材料具有良好的生物相容性,缓释的纳米微粒穿过致密硬化骨,被骨细胞胞饮吸收,发挥细胞层面的治疗与修复作用。