蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)原产于中国,为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生草本植物,又名九子兰、夏兰等。蕙兰香味浓郁,花小巧优雅,栽培历史悠久,符合中国人的审美,观赏价值和经济价值较高。由于蕙兰生长速度慢,繁殖系数低,自然选种、杂交育种和诱变育种具有周期长等缺点,无法满足市场需求。通过基因工程技术进行有目的的育种,既缩短了育种周期,又可克服远缘杂交不亲和障碍,成为培育蕙兰新品种的重要手段。目前,国内外对蕙兰的研究报道较少,关于蕙兰基因工程育种方面的研究亦不多。本研究以蕙兰为试验材料,利用新一代测序技术对蕙兰花芽和营养芽进行转录组深度测序,建立花芽和营养芽转录组数据库,并从中分离了4个CYC-like基因,分析其序列特征及其在蕙兰中的表达,进一步构建正义表达载体,同时将CfCYC1转化夏堇并对夏堇转基因植株进行了性状鉴定,初步分析了其功能,为蕙兰花型研究提供了理论依据。研究结果如下:1、对蕙兰花芽和营养芽进行转录组测序,获得172,959个总Unigene(平均读长为698bp)。对总Unigene利用BLAST检索NCBI蛋白质数据库,发现共有65,577(37.91%)条Unigene比对到至少一条序列(E-value<1.0e-5)。GO分类分为49个功能群,COG分类分为24个同源簇,KEGG分为275条代谢通路。用FPKM法对花芽和营养芽的差异表达基因进行分析,结果发现共有13,484个差异表达基因(DEGs),其中5,801条基因在花芽中上调,7,683条在花芽中下调(FDR≤0.05)。重点分析花器官发育、花型发育和开花相关的基因表达模式,发现一些基因在花芽和营养芽中的表达水平存在显著差异。挑选了 10个花发育相关基因进行qRT-PCR验证转录组测序的准确性及其表达模式。2、根据蕙兰转录组测序结果及已报道蝴蝶兰全基因组测序结果,以蕙兰花芽为材料,采用CTAB法提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术从蕙兰中分离得到4个TCP家族CYC-like基因,并对其序列特征进行分析。结果表明,CfCYC1基因的cDNA全长为1066bp,ORF为927bp,编码308个氨基酸;CfCYC2基因的ORF为975bp,编码324个氨基酸。CfCYC3基因的ORF为1005bp,编码334个氨基酸;CfCYC4基因的ORF为870bp,编码289个氨基酸。与其它物种的TCP氨基酸序列比对显示,CfCYC1、CfCYC2、CfCYC3、CfCYC4与金鱼草、百脉根的CYC同源基因高度同源,均包含TCP基因家族的TCP-domain和R-domain。系统聚类分析表明这4个基因均属于CYC/TB1亚家族。3、通过qRT-PCR发现蕙兰中4个CYC-like基因在不同组织和器官及其花器管不同部位均有表达,其中CfCYC1在花芽中表达量最高,CfCYC2、CfCYC3和CfCYC4在营养芽中的表达量最高。通过对植物载体pCAMBIA1302及蕙兰4个CYC-like基因的酶切位点进行分析,分别选用限制性内切酶Nco I和Spe I、BglΠ和Spe I、BglΠ和Spe I、Nco I和Spe I 对原有质粒 pTG19-CfCYC1、pTG19-CfCYC2、pTG19-CfCYC3、pTG19-CfCYC4及植物载体pCAMBIA1302进行双酶切,对目的片段进行回收、连接、测序,并通过双酶切验证重组质粒的准确性。结果表明,成功构建了正义表达载体pCAMBIA1302-CfCYC1、pCAMBIA1302-CfCYC2、pCAMBIA1 302-CfCYC3、pCAMBIA1 302-CfCYC4。4、将蕙兰CfCYC1基因通过农杆菌介导法转入夏堇,经PCR鉴定获得了转Cf℃YC1基因夏堇植株。通过比较转基因和野生型夏堇的花器官特征,初步分析发现Cf℃YC1基因对夏堇花器官发育具有较大的影响。