外泌体(Exosome)是直径30-150nm的内吞膜来源的细胞外微小囊泡,可由各种类型的细胞分泌到胞外,并稳定地存在于体液中,例如血浆、尿液、唾液和母乳等。外泌体广泛参与细胞间通讯。最近越来越多的研究显示,外泌体内含物可以作为疾病诊断和预后的新型生物标志物。在这里,我们总结了外泌体的生物学特性、外泌体分离和鉴定技术以及外泌体生物标志物鉴定的进展情况,展现外泌体与人类疾病的相关性及其在转化医学中的意义和巨大潜力。骨质疏松症(Osteoporosis,OP)在整个世界范围内都是一种主要的公共卫生问题。迄今,OP的病理学机制仍然是未知的。而骨密度(Bone Mineral Density,BMD)是被广泛用来诊断OP的金标准。最近几年,科研人员广泛采用基于差异表达的蛋白质组学技术来鉴定和验证与疾病相关的蛋白生物标志物。根据这个思路,我们计划了这项从中国老年女性血浆外泌体中鉴定OP潜在的蛋白生物标志物,并探究其可能导致OP的分子机制。根据我们的计划,这项研究主要分成两章:第一章,对外泌体内含物作为生物标志物进行一个整体的分析和总结;第二章分为三节:第一节,基于定量蛋白质组学非标记定量的方法,我们从中国老年女性的血浆外泌体样本中筛选与OP相关的蛋白生物标志物;第二节,我们运用平行反应监测技术(Parallel Reaction Monitor,PRM)和酶联免疫吸附试验方法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)验证第一节非标记定量质谱方法筛选出的候选蛋白在血浆外泌体样本各组间的情况,并观察目的蛋白在血浆中的含量情况;第三节,我们通过体外的细胞实验观察在目的蛋白的不同浓度梯度的培养条件刺激下,对成骨细胞系的增殖活性及分化功能的影响。研究目的:本研究旨在运用蛋白质组学方法技术从中国女性老年人的血浆外泌体样本中筛选OP相关的潜在的蛋白生物标志物。采用非标定量蛋白质组学研究初步筛选OP相第一篇血浆外泌体中骨密度相关蛋白标志物的初步筛选与验证关的蛋白质,采用PRM技术验证OP相关蛋白质;并采用ELISA检测OP相关蛋白质在血浆样本中随骨密度变化的规律。针对通过多次验证、确证与OP相关的候选蛋白,进一步通过体外细胞实验观察其对成骨细胞功能的影响。研究方法:我们招募了 12个极端高骨密度的志愿者为高骨密度组(年龄均值71岁,简写为FH)和12个匹配年龄与性别的极端低骨密度的志愿者为低骨密度组(年龄均值70岁,简写为FL)构成了女性血浆外泌体样本。血浆外泌体首先从外周血血浆中分离。通过 Label-Free(Easy-nLC and Q-exactive,Thermo Scientific)的蛋白质组学方法获得蛋白含量数据。并利用 Maxquant(Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried,Germany,version 1.3.0.5)和Perseus(Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried,Germany,version 1.3)软件处理后,获得样本的蛋白质组学的含量数据,接着我们按照差异倍数(Fold Change,FC)大于1.5或者小于0.67,P值小于0.05的标准从高、低骨密度组间筛选得到有差异的蛋白,并将其定义为差异蛋白(Differential Proteins,DPs)。我们采用生物信息学分析,包括聚类分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析、基因本体数据库(Gene Ontology,GO)功能富集分析、蛋白质与蛋白质交互作用分析(Protein-Protein Interaction,PPI),来对DPs进行功能注释。此外,我们通过PRM技术来观察女性样本中血浆外泌体水平目的蛋白在各亚组间的表达差异。PRM所采用的实验样本都是中国老年汉族女性。运用PRM技术检测第一章筛选出来的候选蛋白(APOL1、F5、PROS1、QSOX1、VTN、VWF)在12例极端低BMD和12例极端高BMD样本的表达情况。运用t检验分析候选蛋白在FL/FH组间的样本表达差异情况。ELISA实验中所采用的样本都是中国老年汉族女性。运用ELISA技术检测APOL1 蛋白在40例低 BMD和 40例高BMD样本(BMD:0.53±0.04 vs.0.97±0.04 g/cm2)的血浆样品中的含量。我们运用t检验的方法分析血浆APOL1蛋白在FL/FH组间样本表达差异情况。第二次APOL1蛋白ELISA实验样本为40例低BMD人群和40例高 BMD 人群(BMD:0.58±0.01vs.0.90±0.02 g/cm2),采用 t 检验分析获得 APOL1蛋白在FL/FH组间的血浆含量差异情况。人类胎儿成骨细胞系(Human Fetal Osteoblasts,hFOB1.19)是成骨细胞的前体细胞,因此能够在合适的培养条件下能被刺激并分化成为成熟的成骨细胞。我们将人类重组APOL1蛋白加入到hFOB的培养基中,形成0,1.25,2.5,5,10ng/ml的APOL1蛋白浓度梯度。通过RTCA S16仪器进行实时监测,并记录48小时内hFOB细胞在不同浓度APOL1蛋白刺激下细胞指数(Cell Index,CI)的变化。我们利用实时荧光定量PCR观察不同浓度梯度APOL1蛋白刺激下,与成骨功能相关的基因,如碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白A1(COL1A1)、骨桥蛋白(OPN)的表达水平变化。研究结果:我们在极端高、低骨密度组的血浆外泌体中共鉴定筛选得到52个DPs,这些DPs主要富集的生物过程有细胞代谢过程、细胞大分子代谢过程、内质网和氮化物代谢过程的负调节等,并且主要富集在补体系统信号通路上。APOL1、F5、PROS1、QSOX1、VTN、VWF这6个蛋白在低骨密度组较高骨密度组下调,且差异具有统计学意义(P<0.05)。并且这六个蛋白位于交互作用网络中央、并与多个DPs相互作用。运用PRM技术发现:只有APOL1蛋白在低BMD组较高BMD组显著下调(FC=0.53,P=0.002)。运用ELISA技术,在血浆水平的FL/FH组间也观察到相同的下调趋势(FL vs.FH:0.5 vs.1.57ng/ml,,P=0.0012);APOL1 蛋白在低 BMD 组含量下调的趋势在第二次独立样本的ELISA实验得到重复(FL vs.FH:0.86 vs.1.23ng/ml,P=0.0193)。在体外细胞实验中,与未加人类重组APOL1蛋白的对照组相比,不同浓度梯度的APOL1蛋白对成骨细胞的增殖未见显著差异。实时荧光定量PCR实验结果显示,不同APOL1蛋白浓度梯度下成骨相关基因(ALP,COL1A1,OPN)的表达水平未见显著差异。研究结论:血浆APOL1蛋白可能是女性OP潜在的蛋白生物标志物。该蛋白质不影响成骨基因的表达、增殖活性与分化功能。该蛋白质是否具有其它骨生物学功能尚待深入研究。第二篇载脂蛋白B与骨密度的因果关系推断:孟德尔随机化研究研究目的:载脂蛋白 B(Apolipoprotein B,ApoB)是低密度脂蛋白(Low Density Lipoprorein,LDL)的主要载脂蛋白,在细胞识别和摄取LDL中起重要作用。骨密度(Bone Mineral Density,BMD)是诊断骨质疏松症的主要临床指标。传统的流行病学研究已经证实血浆中循环代谢物ApoB和BMD存在统计上的关联,但两者之间的因果关系还存在争议。因此我们设计了这项研究来探究ApoB与BMD之间的因果关系。研究方法:通过已经公开发表的全基因组关联研究(Genome Wide Association Study,GWAS)数据库获取血浆循环代谢物ApoB和BMD的GWAS数据,并对数据进行初步整理。本研究采用逆方差加权(inverse variance weight,IVW)的方法进行分析。而且为了保证研究结果的准确性,进行异质性检验(MR-Egger回归)和敏感性分析。研究结果:经过工具变量(Instrumental Variables,IVs)的挑选与验证,23个IVs被纳入到两样本孟德尔随机化分析。IVW的分析表明血浆ApoB和BMD的β值为0.016(95%CI:0.003-0.029,P<0.05),即:表明对于血浆中循环ApoB,每增加一个标准差,BMD增加1.6%。MR-Egger回归结果表明,遗传多效性未能改变结果(截距=0.001,P=0.601)。敏感性分析表明,β稳定在0.016。这些结果一致表明,ApoB与BMD之间存在因果关系。研究结论:两样本孟德尔随机化的分析表明血浆循环ApoB与BMD之间存在因果关系。研究结果提示ApoB与BMD因果关联机制值得深入研究。该研究为其他因果关系不明确的复杂性状提供了研究思路和方法。