【摘 要】
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大豆作为常见过敏食物之一,其制品的广泛应用在很大程度上增加了大豆过敏的发病率;然而,针对大豆过敏防治的研究却非常有限。研究表明,益生菌具有调节免疫系统、稳定肠道内环境稳态、保护肠道屏障等重要生理功能,因此,它可在调控食物过敏中发挥重要作用。乳酸菌作为一类重要的益生菌,它的抗过敏作用也备受关注,其相关研究主要集中于活菌的直接使用。然而,有研究表明免疫力低下人群直接使用活的乳酸菌可能会出现严重的不良反
【基金项目】
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国家自然科学基金项目:豆奶在乳酸菌发酵期间的致敏性变化及其机制研究（批准号:31760453）；
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大豆作为常见过敏食物之一,其制品的广泛应用在很大程度上增加了大豆过敏的发病率;然而,针对大豆过敏防治的研究却非常有限。研究表明,益生菌具有调节免疫系统、稳定肠道内环境稳态、保护肠道屏障等重要生理功能,因此,它可在调控食物过敏中发挥重要作用。乳酸菌作为一类重要的益生菌,它的抗过敏作用也备受关注,其相关研究主要集中于活菌的直接使用。然而,有研究表明免疫力低下人群直接使用活的乳酸菌可能会出现严重的不良反应。因此,开展抗过敏乳酸菌菌株的有效形式及其抗过敏作用机制研究,将为生产安全高效的抗过敏乳酸菌制品提供理论依据。课题组前期已得到三株具有抗大豆过敏效果的乳酸菌,本论文首先采用KU812细胞脱颗粒模型从中初步选定抗过敏作用最佳的一株菌作为模式菌株,将其分为菌培养上清、活菌、灭活菌体三种形式,分别评价不同形式的乳酸菌在干预细胞脱颗粒中的效果;其次,采用Caco-2细胞炎症模型评价不同形式的乳酸菌的抗炎能力,并构建Caco-2细胞单层模型评价不同形式的乳酸菌对肠道屏障的保护作用;最后,采用小鼠肠系膜淋巴结（MLN）细胞评价不同形式的乳酸菌在肠道黏膜免疫组织中调控食物过敏相关细胞因子平衡的能力;另外,对模式菌株的培养基组成及其培养条件进行优化,研制具有良好抗大豆过敏效果的乳酸菌制剂。研究的主要方法、结果及结论如下:1.构建体外人外周血嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒模型,选取具有抗大豆过敏作用的三株乳酸菌为研究对象,以不同形式的乳酸菌干预KU812细胞脱颗粒,分析不同形式的乳酸菌干预对细胞脱颗粒程度的影响。结果表明:不同菌株间存在显著性差异,其中,德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC 6103显示出较好的干预效果,主要表现在抑制组胺、IL-6和TNF-α释放方面占优势;以德氏乳杆菌保加利亚亚种为模式菌株初步探究乳酸菌的抗过敏作用模式,发现活菌和灭活菌体均有效抑制细胞脱颗粒,菌培养上清与MRS培养基相比无显著差异。2.建立脂多糖（LPS）诱导的Caco-2细胞炎症模型,以不同形式的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行干预,以细胞分泌的IL-6、IL-8水平为指标,评价不同形式的乳酸菌对肠上皮细胞炎症的影响。结果表明:活菌和灭活菌体均能抑制LPS引起的IL-6和IL-8水平升高,从而缓解LPS引起的炎症反应,并且适当剂量的活菌和灭活菌体可将IL-6和IL-8水平恢复至正常水平,但菌培养上清对细胞炎症反应无显著性影响。3.采用Caco-2细胞单层模型,以细胞单层的跨膜电阻值（TEER）和荧光素钠透过率为指标,评价不同形式的德氏乳杆菌保加利亚亚种对肠上皮屏障完整性和通透性的影响。结果表明:在正常状态下,不同形式的德氏乳杆菌保加利亚亚种不会对肠上皮屏障造成不良影响。而在减轻肠上皮屏障功能受损程度上,德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌培养上清和活菌表现出较好的维持肠上皮屏障完整性和通透性的能力。4.分离小鼠MLN,首先确定免疫MLN细胞的最佳大豆蛋白浓度,随后将大豆蛋白和不同形式的德氏乳杆菌保加利亚亚种分别加入到MLN细胞中共孵育,以细胞因子水平为指标,评价不同形式的德氏乳杆菌保加利亚亚种对大豆蛋白诱导的MLN免疫反应的干预作用。结果表明:20μg/m L的大豆蛋白导致MLN细胞IFN-γ和IL-10水平显著降低,促使免疫反应向Th2方向发展。菌培养上清对大豆蛋白引起的免疫偏离无显著影响;低剂量的活菌导致细胞的IFN-γ分泌水平过高,无法改善IFN-γ/IL-4平衡,其调节IL-10水平的能力也有限;然而灭活菌体可使IFN-γ和IL-10水平升高至正常水平,恢复IFN-γ/IL-4平衡,从而扭转大豆蛋白诱导MLN细胞的免疫偏离。5.为获得高密度的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体,首先基于MRS培养基,优化了培养基中菌株生长所需的碳源、氮源和缓冲盐种类;采用响应面法优化了菌株的培养条件。结果表明:优化的菌株培养基中碳源为葡萄糖,氮源为酵母提取物,缓冲盐为柠檬酸钠;菌株最佳培养条件为培养温度37.6℃、初始p H 7.4、接种量5%。利用优化后培养基与培养条件,菌株的菌落数分别增长了23.5%和23.8%,可得到浓度为2.6×10~9 CFU/m L的菌体;收集发酵得到的大量菌体并灭活,制成灭活菌粉,加入益生元完成抗过敏菌剂的研制。
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