研究背景:生物人工肾(bioartificial kidney BAK)是目前治疗终末期肾病的有效方法,BAK是肾脏组织工程研究的重点之一,其研究包括两个方面:生物人工肾小管和生物人工肾小球的研究,目前国外生物人工肾系统已经完成由美国食品药品管理局(FDA)批准的Ⅰ/Ⅱ期临床实验,并取得了令人鼓舞的效果。尽管肾脏组织工程研究已取得了极大的进展,但仍存在关键的问题有待解决。首先,生物人工肾的构建需要数量巨大的种子细胞,因此,如何在单位时间内提高肾脏组织工程种子细胞的产量是发展生物人工肾系统的关键之一。其二,生物人工肾小球或生物人工肾小管各自的功能单一,如何构建既有生物人工肾小球的滤过与抗凝功能、同时又有生物人工肾小管重吸收功能的生物人工滤器是发展生物人工肾系统的关键之二。1.肾脏组织工程种子细胞的问题生物人工肾的种子细胞可以来自体细胞或各种来源的干细胞,但是,若采用正常组织提供种子细胞,由于正常成体细胞在体外增殖的能力有限,因此得到的种子细胞数量较少;而胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源,则受到伦理道德的严格约束;其他来源的干细胞的分离及纯化又受到培养或诱导条件等因素的制约。在本研究的实验研究一中,针对提高单位时间内种子细胞产量的问题,我们应用促细胞增殖的人Nanog基因(hNanog)转染肾脏组织工程的两种种子细胞——人脐静脉血管内皮细胞ECV304与人肾小管上皮细胞HKC,结果显著促进了ECV304细胞与HKC细胞的增殖,因而可提高单位时间内肾脏组织工程种子细胞的产量,此为克服肾脏组织工程种子细胞的不足提供了一条有效的途径。2.生物人工肾小球/小管功能单一的问题目前生物人工肾小球、生物人工肾小管如肾小管辅助装置(renal assistdevice,RAD)只是分别模拟了肾小球、肾小管部分的功能,各自的功能单一,且存在着如下弊端:①由于整个过程需要血液滤过装置和生物人工肾泄茏爸?因而结构较复杂;②生物人工肾小管不具备抗凝功能,需持续给予肝素进行抗凝;③生物人工肾小球无重吸收功能,不能对超滤液中的营养物质进行重吸收,因而影响患者的预后。针对目前BAK系统的缺陷,我们考虑采用如下方法进行改进:把生物人工肾小球与生物人工肾小管进行“组合”,以利于生物人工肾系统功能的复合化。在本研究的实验研究二中,我们把血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC等比例混合后种植在层黏连蛋白包被的AV400滤器中,让构建的生物人工滤器同时兼备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能,形成一个类似生理意义上的“肾单位”,可称之为“生物人工肾单位”。方法:1.制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC,光镜下观察两种细胞转染后细胞形态的状况、同时应用MTT检测转染后细胞增殖的情况;转染hNanog基因48小时后,用BrdU(S期细胞的标志物)间接免疫荧光和流式细胞仪分别检测ECV304与HKC两种细胞处在DNA合成期的细胞数目、处于S期细胞的百分比;经G418筛选获得表达hNanog基因的ECV304—hNanog细胞与表达hNanog基因的HKC—hNanog细胞、鉴定hNanog基因在ECV30—hNanog细胞以及HKC—hNanog细胞中的表达;2.以层粘连蛋白包被的AV400滤器(Fresenius公司0.7m~2)为载体,分别检测ECV304细胞、HKC细胞、ECV304与HKC两者的等比例混合细胞、ECV304—hNanog细胞、HKC—hNanog细胞、ECV304—hNanog与HKC—hNanog两者的等比例混合细胞对聚砜膜中空纤维材料的黏附状况;3.在明确ECV304—hNanog细胞与HKC—hNanog细胞对聚砜膜中空纤维材料黏附状况的基础上,通过ECV304—hNanog与HKC—hNanog等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位,并设立对照组及空白对照组,用Hoechst染色、PKH26/PKH67染色检测两种转染细胞混合种植后在聚砜膜中空纤维上的密度及各自的分布情况,用扫描电镜观察种植细胞的生长状态;4.采用ECV304—hNanog与HKC—hNanog等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位,设立对照组及空白对照组,在体外对构建的生物人工肾单位进行内分泌功能与重吸收功能的测定,并对其重吸收功能的特性进行研究。结果:1.rAAV2-hNanog转染肾脏组织工程种子细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在ECV304—hNanog细胞及HKC—hNanog细胞中稳定表达;2.ECV304及HKC细胞在转染后的增殖能力显著增强(P＜0.05);3.光镜下观察发现,ECV304与HKC细胞转染前后的细胞形态无明显改变;4.两种细胞转染后,BrdU间接免疫荧光证明ECV304和HKC细胞处于DNA合成期的细胞数量明显增多(p＜0.01);5.两种细胞转染后,细胞周期检测发现ECV304细胞的S期细胞的百分比明显增大(p＜0.01)、HKC细胞的S期细胞的百分比也明显增大(p＜0.05);6.ECV30A—hNanog细胞及HKC—hNanog细胞可在中空纤维的表面混合生长,并形成单层;7.转染细胞混合组(ECV304—hNanog与HKC—hNanog细胞等比例混合种植构建)、转染ECV304组(ECV304—hNanog细胞构建)、转染HKC组(HKC—hNanog细胞构建)及空白组(未种植细胞)比较,转染细胞混合组比转染HKC组及空白组能分泌更高的内皮素(P＜0.01),但低于转染ECV304组(P＜0.05);转染细胞混合组比转染ECV304组与空白组能分泌更高的6-酮-前列腺素F1α,但低于转染HKC组(P＜0.01);转染细胞混合组对葡萄糖、钠的重吸收量显著高于转染ECV304组与空白组(P＜0.01),但低于转染HKC组(P＜0.01)。结论:1.hNanog基因能提高血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC的增殖能力,进而增加单位时间内血管内皮细胞与肾小管上皮细胞的产量,此为生物人工肾的快速构建及应用提供了一种新方法;2.采用转染的血管内皮细胞与转染的肾小管上皮细胞混合种植所构建的生物人工滤器,具备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能,可作为一个“生物人工肾单位”,此为生物人工肾系统功能的复合化奠定了实验基础。