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2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)是一种重要的人畜共患病病原体。S.suis2感染不仅可致猪的急性关节炎、脑膜炎、败血症、心内膜炎及急性死亡,并且可通过呼吸道和伤口等途径传播,导致人类的感染发病和死亡。科学家在丹麦发现并首次报道人感染S.suis2病例,随后在世界各地都有报道,但多为散发病例。然而,1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S.suis2感染猪和人类疫情,病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxicshock syndrome,STSS),临床症状表现为急性高热、休克、全身多器官衰竭,病程短而凶险,致死率高,引发严重的公共卫生事件。
为了对造成这两次暴发感染事件的S.suis2流行菌株的高致病性进行深入研究,我们课题组对1998年江苏分离的强致病株98HAH12和2005年四川分离的强致病株05ZYH33(两株均分离自STSS病人)进行了全基因组测序和功能注释,并与Sanger研究中心公布的标准株P1/7的全基因组序列进行比较,发现了我国分离的这两株测序菌株均含有一个89 kb大小的具有毒力岛(pathogenicity island,PAI)特征的大片断,我们将这个特异性的片段命名为89K PAI。随后对89K PAI行生物信息学分析,发现89K PAI编码多个可能与致病相关的成分和结构,如二元信号转导系统(two-component signaltransduction system,TCS),Ⅳ型分泌样系统(typeⅣ-like secretion system,T4SS-like)以及一个Zeta毒素等。我们通过实验证实了这个二元信号转导系统SalK/SalR参与了细菌的致病过程,而Ⅳ型样分泌系统则参与了STSS的形成。
近期研究表明该毒力岛可以从宿主菌染色体上自发切离下来,并在染色体上形成类似质粒的环化分子,该环化分子可作为底物通过Ⅳ型样分泌系统介导转移至不含89K毒力岛的S.suis2受体菌中。我们试图通过各种诱导质粒消除的方法获得一株89K毒力岛缺失的S.suis2突变株,但始终未能成功。我们推测毒力岛上存在一个参与稳定作用的结构。进一步生物信息学分析发现89K毒力岛有一个与Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素(typeⅡ toxin-antitoxin)系统,我们将其命名为SezAT(Streptococcus suis epsilonzeta)系统,其中SezA为抗毒素蛋白,SezT为毒素蛋白。近期研究发现TA系统可在细菌的一些可移动遗传元件中发挥稳定作用。因此,高致病性S.suis2的89K PAI编码的SezAT系统很可能参与到89K PAI的稳定机制当中。但生物信息学分析结果只能是提示,该TA系统是否具有生物学功能尚需实验验证。为此,本文旨在对89K PAI编码的SezAT系统行活性验证,并通过同源重组的方法对SezAT系统进行敲除,为下一步验证其功能和获得89K PAI缺失突变株奠定基础。具体实验内容和结果包括以下几个方面:
1.SezAT系统的生物信息学分析和RT-PCR验证:我们通过生物信息学分析发现,89K PAI的负链上05SSU0936(sezT)和05SSU0937(sezA)构成一对Ⅱ型TA系统并与Epsilon-zeta(ε-ζ)同源,且两ORF有一个碱基对的重叠,提示两ORF共转录。为证实两ORF共转录,抽提S.suis2的总RNA行RT-PCR,结果证实两ORF共转录。
2.SezAT系统的活性分析:以05ZYH33基因组DNA为模板,分别扩增SezA和SezT编码基因的全长片段,分别插入双启动子表达质粒pJS298中,构建重组质粒pJS-AT。通过电转化的方法导入到大肠杆菌BL21(DE3),分别用一定浓度的诱导剂IPTG(终浓度为1 mM)和L-阿拉伯糖(0.2%)诱导表达,同时设定不同时间点测定菌液的OD600值,绘制生长曲线。结果显示,单纯诱导表达毒素蛋白SezT可在短时间内迅速抑制细菌生长,而同时诱导表达抗毒素蛋白SezA可中和SezT的抑制作用,维持细菌正常生长。提示该SezAT系统构成一对有活性的TA系统。
3.SezAT系统基因敲除突变株的构建:以S.suis05ZYH33的基因组DNA为模板,设计特异性引物,PCR分别扩增sezT单基因和sezAT的左右臂(上下游片段);同时以穿梭质粒pSET2的DNA为模板,PCR扩增壮观霉素抗性基因SpcR片段,分别将它们克隆到pUC18载体的多克隆位点上,构建成用于靶基因敲除的载体pUC::SezT和pUC::SezAT。分别将敲除载体电转化至05ZYH33感受态细菌,筛选具有壮观霉素抗性的S.suis2菌落。通过PCR初筛、多重PCR复筛及测序的方法获得具有壮观霉素抗性的sezT基因敲除突变株△sezT,但未能获得sezAT的敲除突变株。后续对突变株△sezT基本生物学性状(生长速率)及致病性研究显示与野生株无明显差异,提示SezAT系统不直接参与致病过程。
综上所述,本研究以S.suis05ZYH33为研究对象,通过生物信息学分析及RT-PCR检测提示89K毒力岛上SezAT系统的两基因共转录。通过重组质粒诱导SezAT系统蛋白过表达证实SezAT系统是有活性的TA系统。通过基因敲除技术获得了sezT基因缺失突变株△sezT,成功破坏该TA系统结构。突变株△sezT基本生物学性状研究和小鼠攻毒结果显示,sezT基因缺失未影响S.suis2的生长和致病性,即提示该TA系统与致病性无直接相关。下一步我们将以sezT基因缺失突变株△sezT为基础,通过电转等诱导消除的方法尝试获得89K PAI的缺失突变株。本课题研究工作不仅丰富了对TA系统的认识,同时也为从整体水平阐明89K毒力岛在我国高致病性S.suis2中的STSS的关系奠定基础。