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研究背景:跟腱损伤通常发生在跟腱与跟骨的腱骨交界面以上2-6cm的低血管化区,其中约80%发生在运动活动中,由腓肠肌-比目鱼肌复合体的突然收缩引起。临床及实验室研究发现,跟腱作为人体最粗最大的肌腱之一,其氧耗低、寡血供的特点导致损伤后修复进程缓慢,并且往往难以恢复到损伤前的生理结构及功能,再次发生损伤率较高。尤其近年来,随着运动人群的增加,跟腱损伤的发病率逐年上升;与此同时,目前临床上对于跟腱损伤主要为手术治疗,以期达到快速恢复、重返运动的目的,但临床疗效往往不佳,大大影响了普通患者的日常活动和专业运动员的职业生涯,因此跟腱损伤修复依然是目前运动医学面临的棘手问题,对跟腱损伤修复展开深入研究迫在眉睫。研究表明,雌激素是影响跟腱损伤并参与损伤修复的重要内在因素之一。Hammar等人发现女性运动员跟腱损伤发病率随体内雌激素水平的降低而升高;Esra等人发现雌激素可以促进大鼠跟腱损伤愈合中成纤维细胞的增殖。雌激素主要通过激活其受体发挥作用,其中雌激素β受体(ERβ)在2010年首次被发现普遍在肌腱组织中,一项关于大鼠跟腱损伤修复的研究表明,ERβ具有积极的作用。所以我们推测:ERβ不仅与跟腱损伤的发生相关,并且在跟腱损伤修复过程中起关键作用。跟腱损伤的自然愈合进程是一个包括炎症期、增殖期和重塑期在内的连续过程,修复早期为随后的细胞外基质产生及重塑提供物质基础,其正常进行对整个修复过程至关重要;细胞外基质为跟腱内细胞成分提供生存坏境,其有序排列赋予跟腱组织足够的机械强度,因此在重塑期其是否能够重新排布从而恢复正常结构对肌腱断裂的修复具有重要意义。因此,明确ERβ在跟腱损伤修复早期和重塑期分别发挥的作用及调控机制有助于指导跟腱损伤修复的临床治疗。基于上述问题及研究现状,我们可以推断:ERβ作为一种内源性调控因子可能与跟腱损伤的发生密切相关,并参与调控修复早期、重塑期过程。因此本研究为明确ERβ在跟腱损伤修复中的作用及机制,利用ERβ纯合敲除小鼠(ERβ-/-小鼠)与其配对的对照组野生型小鼠(WT小鼠)建立双后肢跟腱断裂模型,分别在术后7天和术后28天收取样本(分别对应损伤修复早期和重塑期),观察、比较、分析ERβ缺乏对跟腱损伤修复的作用,并最终阐释其机制。1 ERβ对小鼠跟腱损伤修复早期的影响及机制本章研究通过对ERβ-/-小鼠与配对的C57/BL6小鼠在体建立小鼠跟腱损伤模型,在术后7天收取跟腱标本,观察ERβ对小鼠跟腱损伤修复早期的影响及机制。1.1实验方法1.1.1建立小鼠跟腱损伤模型:对骨骼肌肉系统发育成熟的成年(6月龄)ERβ-/-小鼠与配对的C57/BL6小鼠进行双后肢跟腱全层离断再固定手术,术后常规固定。术后7天收取跟腱标本。1.1.2通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)和油红O染色(Oil Red O staining)等组织化学染色,TUNEL染色、Ki67、ERβ免疫组织化学染色,DPAI、CD34、Perilipin等免疫荧光染色,来观察比较小鼠正常跟腱组织与两组损伤修复早期的跟腱组织组织学表现。1.1.3分别通过PCR和WB在m RNA和蛋白质水平对PPARγ成脂分化通路相关分子CD36、PPARγ、FABP4以及脂肪表达相关分子Adiponectin、Lpl、RBP4的在两组跟腱组织损伤修复早期的表达情况,以探究PPARγ通路在ERβ影响跟腱组织损伤修复早期脂肪堆积的可能机制;通过WB在蛋白质水平对VEGFA/VEGFR、ERK、PTEN/AKT/p53这三条分别于新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡相关通路的表达情况。1.1.4分离、鉴定、培养大鼠来源的肌腱源性干细胞(Tendon-derived stem cells,TDSCs),筛选LY3201激活ERβ的最适浓度和最佳时间,通过CCK-8,PCNA与Brd U细胞免疫荧光染色来观察比较不同浓度梯度、不同时间的LY3201对TDSCs刺激后对其增殖情况的影响;通过油红O染色以及PCR对成脂分化相关分子PPARγ和FABP4的半定量测定来观察比较不同浓度梯度的LY3201对成脂分化培养的TDSCs刺激后对其成脂分化情况的影响1.1.5在LY3201刺激的成脂分化培养的TDCSs中同时加入PPARγ通路激活剂ROSI(通过查阅文献确定实验浓度为10μM),通过油红O染色及PPARγ细胞免疫荧光染色来观察比较其与单纯LY3201刺激组的表达变化情况,通过PCR和WB分别在m RNA和蛋白质水平检测PPARγ成脂分化通路上的相关关键分子CD36、PPARγ、FABP4的表达情况,并与单纯LY3201刺激组进行比较分析,以探究PPARγ通路在ERβ影响TDSCs成脂分化的可能机制。1.2实验结果1.2.1 ERβ在跟腱损伤修复早期大量表达,ERβ缺乏会导致小鼠跟腱损伤修复早期组织学表现变差,主要表现为:组织学评分降低、细胞凋亡增多而增殖减少、新生血管增多以及大量的脂肪细胞浸润,并伴有PPARγ通路相关分子CD36、PPARγ、FABP4的表达明显增高。1.2.2结合浓度依赖和时间依赖确定10-7 M的LY3201刺激TDSCs48h可以在不明显影响ERα和GPER表达的情况下显著激活ERβ的表达,并促进TDSCs的增殖;刺激成脂分化培养的TDSCs会抑制其脂肪分化,表现为油红O染色标记的脂肪数目减少,PPARγ通路相关分子CD36、PPARγ、FABP4在m RNA和蛋白质水平表达降低。1.2.3 PPARγ通路激活剂ROSI可以逆转10-7 M的LY3201刺激成脂分化培养的TDSCs所带来的抑制脂肪分化作用,表现为油红O染色代表的脂肪细胞数目增多、PPARγ通路相关分子CD36、PPARγ、FABP4在m RNA和蛋白质水平表达增多。1.3小结1.3.1明确了ERβ在小鼠跟腱损伤修复早期中的作用:本章研究通过多种组织学染色方法发现了ERβ缺乏会导致损伤修复早期的小鼠跟腱组织表现出以脂肪细胞浸润增多为主要特点的修复不良,并伴随新生血管生成增多,细胞增殖减少、凋亡增多等组织学表现。1.3.2探究了ERβ影响小鼠跟腱损伤修复早期的可能机制:通过PCR和WB分别RNA和蛋白质水平证明了由于ERβ与PPARγ的相互作用,当ERβ缺乏时,PPARγ被激活,表达升高,进而激活PPARγ成脂分化通路,促进下游成脂分化因子FABP4的表达,从而导致小鼠跟腱损伤修复早期脂肪细胞浸润增多;与此同时围绕PPARγ这一关键调控分子,分别检测了VEGFA/VEGFR、ERK、PTEN/AKT/p53这三条分别与新生血管生成、细胞增殖、细胞凋亡相关通路的表达情况,对脂肪细胞浸润以外的其他组织学表现进行了初步的机制探究。1.3.3阐释了一种ERβ影响小鼠跟腱损伤修复早期脂肪细胞浸润增多的可能途径:ERβ特异性激动剂LY3201可以通过激活ERβ下调PPARγ成脂分化通路,从而抑制TDSCs的成脂分化;初步确立了ERβ特异性激动剂LY3201的细胞水平用药浓度,为临床应用提供实验与理论基础。2 ERβ对小鼠跟腱损伤修复细胞外基质重塑早期的影响及机制本章研究通过对ERβ-/-小鼠与配对的C57/BL6小鼠在体建立小鼠跟腱损伤模型,在术后7天、28天收取跟腱标本,观察ERβ对小鼠跟腱损伤修复重塑期的影响及机制。2.1实验方法2.1.1通过旷场分别对正常、损伤7天、损伤28天的ERβ-/-小鼠与配对的C57/BL6小鼠进行行为学检测,以观察比较两组小鼠在跟腱组织损伤修复重塑期运动能力的变化情况。2.1.2通过生物力学检测分别对损伤28天的ERβ-/-小鼠与配对的C57/BL6小鼠进行跟腱长度、横截面积、最大载荷、刚度等生物力学性质检测,以观察比较两组跟腱组织在损伤修复重塑期生物力学性质的变化情况。2.1.3通过HE染色、天狼星红染色(Sirius Red staining),I型胶原(Collagen type I,Col I)、III型胶原(Collagen type III,Col I)组织免疫荧光染色观察比较两组跟腱组织在损伤修复重塑期组织学表现情况及胶原蛋白的含量和组成;通过PCR在m RNA水平对跟腱组织细胞外基质几种主要组成成分Col I、Col III、TNMD、FMOD进行检测,观察比较两组跟腱组织在损伤修复重塑期几种主要组成成分的变化情况。2.1.4通过m RNA测序筛选出两组跟腱组织在损伤修复早期的差异表达分子,并用WB技术进行验证;通过Swiss Regulon Portal和JASPAR对ERβ与IRF5进行转录因子结合位点进行预测,并采用ERβ和IRF5细胞免疫荧光染色验证二者在TDSCs中的共表达情况。2.1.5通过IRF5和CCL3组织免疫荧光染色,观察比较二者在两组跟腱组织损伤修复重塑期的表达情况,以验证IRF5-CCL3在ERβ影响跟腱损伤修复重塑期I型胶原合成的作用;体外培养肌腱源性干细胞,并用CCL3进行刺激,验证其对肌腱源性干细胞I型胶原合成的促进作用。2.2实验结果2.2.1 ERβ缺乏会导致处于跟腱损伤重塑期的小鼠运动能力变差,表现为相同时间、空间内运动速度、运动距离明显减低;ERβ缺乏会导致处于跟腱损伤重塑期的小鼠跟腱生物力学性质变差,表现为跟腱横截面积、最大载荷明显变小。2.2.2 ERβ缺乏会导致处于跟腱损伤重塑期的小鼠跟腱组织学表现变差、胶原沉积异常,主要表现为I型胶原减少,同时伴有III型胶原、TNMD、FMOD的表达异常。2.2.3 m RNA测序发现ERβ缺乏会导致跟腱损伤修复早期核转录因子IRF5的表达明显降低,WB在体内蛋白质水平验证了这一发现,并通过免疫荧光共聚焦技术确认了IRF5和ERβ在TDSCs上的共表达。2.2.4在体免疫荧光染色发现,ERβ缺乏会导致IRF5和CCL3的表达明显降低;体外TDSCs的CCL3刺激实验证实CCL3可以促进I型胶原的合成。2.3小结2.3.1明确了ERβ在小鼠跟腱损伤修复重塑期的作用:本章研究在第二章研究的基础上,延长了对小鼠跟腱损伤修复的观察时间,在术后28天即重塑期开始时通过生物力学牵拉实验和旷场行为学实验发现,ERβ缺乏会导致重塑期小鼠的跟腱生物力学性质明显下降以及小鼠运动能力的恢复不良;随后通过多种组织学染色方法在组织学水平发现ERβ缺乏会导致小鼠跟腱在重塑期表现为以I型胶原减少为主要特点的细胞外基质构成紊乱。2.3.2探究了ERβ在小鼠跟腱损伤修复重塑期影响I型胶原合成的可能机制:在利用m RNA测序技术筛选出ERβ缺乏与否小鼠跟腱组织表达明显具有差异的基因的基础上,通过生物信息学预测发现ERβ与IRF5存在相同转录结合位点,随后在小鼠组织中验证了ERβ可以通过下调IRF-CCL3轴的表达,导致I型胶原合成受阻从而使得重塑期的小鼠跟腱组织I型胶原减少。