肾细胞癌是肾脏恶性肿瘤最常见的类型,每年约有3%的新增癌症患者是肾细胞癌患者。肾细胞癌的早期临床表现多样,缺乏特异的诊断技术,约60%的肾细胞癌患者是在并未怀疑有泌尿系肿瘤的病人中偶然检出的。肾细胞癌对传统细胞毒性药物和放疗不敏感,虽然靶向药物的应用可改善部分转移性肾细胞癌患者的生存,但其生存中值仍仅有40个月,五年生存率低于10%。而早期肾细胞癌可被手术治愈。因此,在肿瘤转移前进行肾细胞癌的早期诊断,及时监测肿瘤进展状况,变得尤为重要。精囊蛋白1(Sg1)是人类精液的重要组成部分,在精液液化过程中起着至关重要的作用。除了精囊,在人类气管、胰腺、肾脏、前列腺、视网膜中亦有Sg1分布。既往研究表明,Sg1在数种恶性肿瘤中异常表达,如白血病、小细胞肺癌、黑素瘤、前列腺癌等,与患者的肿瘤进程或预后有关。因此我们推测Sg1可能在肾细胞癌的发生发展中起重要作用。本课题拟研究Sg1在肾细胞癌中的表达情况并分析其临床意义,以分子生物学手段探究Sg1在肾细胞癌发生发展中的作用,结果对于进一步阐释肾细胞癌的发病机制,筛选肾细胞癌的生物标记物,以及对肾细胞癌患者实施个体化干预等方面具有重要的理论和实践意义。第一部分Sg1在肾细胞癌中的表达和临床意义目的:肾细胞癌的发病率逐年上升,目前仅有少量的生物标记物可对肾细胞癌的诊断和预后做出预测,我们研究了精囊蛋白Sg1在肾细胞癌患者中的表达和临床意义。方法:采用实时定量聚合酶链式反应检测24例明确诊断为肾细胞癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中的Sg1表达;以蛋白质印迹检测T1-4期肾细胞癌患者组织中Sg1的蛋白水平;并以免疫组化检测53例肾细胞癌标本中的Sg1,对其进行抗原定位,通过随访患者,结合患者的临床指标,进一步研究其临床意义。结果:实时定量聚合酶链式反应显示,与癌旁组织相比,肿瘤组织中的Sg1表达明显降低(P<0.01)。蛋白质印迹进一步证实Sg1在肿瘤中低表达,且T3/T4期患者的Sg1水平显著低于T1/T2期患者。在53例肿瘤组织中,有30例(57%)抗Sg1免疫组化染色呈阳性,显著低于对应癌旁组织的全部阳性(100%),Sg1表达量和肾细胞癌临床分期呈负相关(p T1-2 VS p T3-4,p<0.01),且Sg1表达阴性的病人更易复发(P<0.01)。结论:Sg1在肾细胞癌中低表达,随着肿瘤进展,其表达水平进一步下降,并与患者的预后相关。Sg1可作为预测肾细胞癌进展和预后的生物标记物。第二部分Sg1对肾细胞癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响及其分子机制的探讨目的:Sg1的表达水平和肾细胞癌的进展密切相关,并能在一定程度上反应患者的预后。本课题旨在研究Sg1对肾细胞癌细胞株786-0和ACHN迁移、侵袭和凋亡的影响,并鉴定Sg1的下游靶基因,揭示Sg1缺乏导致肾细胞癌发生发展的分子机制。方法:构建Sg1过表达慢病毒和空载慢病毒,感染786-0和ACHN细胞株,以有限稀释法建立稳定过表达Sg1的786-0和ACHN细胞系。通过MTT实验检测786-0和ACHN细胞增殖能力的改变;通过流式细胞术分别检测786-0和ACHN细胞的周期和凋亡改变的情况;通过Transwell法分别检测786-0和ACHN细胞迁移、侵袭能力的改变;应用蛋白质印迹检测Sg1靶基因JNK的表达以及下游基因c-fos和MMP9的表达情况。以JNK抑制剂sp600125预处理786-0和ACHN细胞,再感染过表达Sg1慢病毒,对比侵袭能力是否改变。结果:建立了过表达Sg1的786-0和ACHN稳定细胞系,在此基础上的MTT实验表明在肾细胞癌细胞株786-0和ACHN中,过表达Sg1不影响肾细胞癌细胞的增殖能力(P>0.05);在细胞周期实验中,Sg1过表达786-0细胞相对于参照组表现出G2/M期阻滞(P<0.05);在Transwell迁移实验中,过表达786-0和ACHN细胞都表现出迁移能力受到抑制(P<0.05);在Transwell侵袭实验中,过表达786-0和ACHN细胞同样表现出侵袭能力受到抑制(P<0.05);凋亡实验表明在786-0和ACHN细胞中,过表达Sg1可以促进肿瘤细胞的凋亡(P<0.05)。采用蛋白质印迹检测靶基因以及下游基因的表达情况,发现Sg1可提高JNK的表达水平,同时降低p-JNK及c-fos和MMP9的表达。应用sp600125处理786-0和ACHN细胞后,过表达Sg1不再进一步抑制786-0和ACHN的侵袭能力(P<0.05)。结论:以上结果表明Sg1可以抑制肾细胞癌细胞786-0和ACHN的迁移、侵袭能力,并促进细胞凋亡。癌基因JNK是Sg1的潜在靶基因,Sg1可以抑制JNK的磷酸化水平,调控JNK-c-fos通路,从而发挥抑癌基因的作用。