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奶牛乳腺炎是乳腺组织受到外界刺激而引起的一系列炎症反应,是奶牛养殖业中发病率最高,经济损失最严重的一种疾病。mi RNA能够参与基因调控表达,已被证实参与新陈代谢、激素的分泌、免疫应答、疾病的发生等各种生物学过程。奶牛机体内乳腺炎相关基因的表达与mi RNA的转录调控密切相关。因此,本研究通过构建奶牛外周血小RNA文库,采用高通量测序技术和生物信息学分析获得健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛中保守和新发现的mi RNA序列,并进一步分析其序列特征;筛选出健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛中差异表达的mi RNA序列并利用定量PCR技术对其进行验证;利用基因克隆、PCR-RFLP等技术对差异表达mi RNA序列的靶基因PRMT2的遗传变异进行了研究;最后还通过构建载体、细胞转染等技术对mi R-146a的靶基因进行了验证,本研究的主要研究结果如下:1.荷斯坦奶牛外周血中miRNA序列的高通量测序采集健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛外周血构建小RNA文库,利用Solexa高通量测序技术分别得到原始序列16,733,120条和9,373,740条,去除低质量数据后,分别获得可用序列10,654,985条8,708,111条,各占原始总数据的63.68%和93.90%。对两个文库的mi RNA序列长度进行分析,发现两个文库中mi RNA序列主要集中在21~23 nt,健康荷斯坦奶牛中长度为21~23 nt的mi RNAs序列占全部mi RNAs序列的83.42%,其中长度为23 nt的mi RNAs序列最多,占到29.82%;患乳腺炎荷斯坦奶牛中长度为21~23 nt的mi RNAs序列占全部mi RNAs序列的85.36%,其中长度为21 nt的mi RNAs序列最多,占到32.53%。2.荷斯坦奶牛外周血mi RNA的鉴定和特征分析将获得的可用序列进行整理、归类分析,所有纯净序列经过比对之后,在两个文库中共检测到608条pre-mi RNA编码753条成熟的mi RNA,其中448条为已知mi RNA;25条为保守mi RNA;270条为新发现mi RNA。将检测到的608条pre-mi RNA在牛染色体上进行定位,共有516条pre-mi RNA可以定位到牛染色体,各染色体上pre-mi RNA的分布密度在0.08~0.58条/Mbp之间,同时还发现:有些mi RNA序列位于同一pre-mi RNA的两端,但它们的测序读数不同,甚至有些序列有很大的差异,具有这样特点的mi RNA序列共有145对。基因簇分析表明:当MID=3 Kb时,134个pre-mi RNA形成56个簇;当MID=10 Kb时,150个pre-mi RNA形成59个簇;当MID=50 Kb时,157个pre-mi RNA形成58个簇。3.荷斯坦奶牛外周血mi RNA的验证为了进一步验证本研究中高通量测序结果的准确性,随机筛选了18条已知mi RNA序列和6条新发现mi RNA序列。利用Stem-loop PCR方法对的mi RNA进行克隆,结果表明24条mi RNA序列均被成功克隆,高通量测序获得的mi RNA序列在荷斯坦奶牛中真实存在。4.乳腺炎相关mi RNA的筛选、功能预测及表达分析对两个文库的mi RNA进行差异表达分析,与健康荷斯坦奶牛相比,患乳腺炎荷斯坦奶牛中共有173条差异表达的mi RNA序列,其中123条mi RNA序列显著上调,50条mi RNA序列显著下调,并利用实时定量PCR随机筛选9条显著下调、5条显著上调的mi RNA序列进行验证。比较健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛中表达量前10的mi RNA序列,发现有8条mi RNA序列在两个文库中均高表达,分别为:bta-mi R-486,bta-mi R-451,bta-mi R-191,bta-mi R-339b,mml-mi R-486-5p,bta-mi R-25,bta-mi R-342和bta-mi R-30e-5p,并且它们在两个文库中的表达量也有差异。对差异表达的mi RNA序列进行靶基因预测,173条mi RNA序列预测到73,703个靶基因,进一步对预测到的靶基因进行GO和KEGG Pathway分析,分析发现:蛋白转运、RNA聚合酶Ⅱ启动子和DNA依靠的转录调控、I-kappa B激酶和NF-kappa B调控等生物学调节过程被显著富集,趋化因子信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、信使RNA监测通路也被显著富集,这些注释结果表明差异表达mi RNA的靶基因在免疫调控、生长发育等过程中发挥着重要的调控作用。5.乳腺炎相关miRNA靶基因PRMT2的遗传变异研究利用PCR扩增和测序发现差异表达mi RNA靶基因PRMT2基因的4个SNP位点,关联分析发现A10276G位点AG基因型个体具有较高的乳蛋白率,C24375T位点CT基因型具有较高的日平均产奶量。发现PRMT2基因的一个可变剪切体并将其成功克隆,序列比对发现其编码279个氨基酸,与PRMT2基因相比缺少第7外显子,导致PRMT2基因二级结构和功能域的改变。实时定量PCR发现PRMT2基因可变剪切体在健康荷斯坦奶牛乳腺组织中表达量显著高于其他组织,在患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺组织中的表达量为健康荷斯坦奶牛的4.02倍。A10276G和C24375T两处突变可以作为分子标记进一步应用于荷斯坦奶牛的抗性育种中。6.mi R-146a靶基因的预测与验证利用生物信息学软件和相关的研究报道预测TRAF6基因和TLR4基因可能为mi R-146a的靶基因,并预测了这两个基因中存在的可能靶位点。构建带有TRAF6基因和TLR4基因可能靶位点的野生型载体和敲除掉可能靶位点的突变型载体,双荧光素酶报告基因检测系统表明TRAF6基因和TLR4基因存在的靶位点均与mi R-146a mimic发生作用,TRAF6基因和TLR4基因均为mi R-146a的靶基因。