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目的:构建基于等级表面增强拉曼散射（Hierarchical surface-enhanced Raman scattering Substrate,H-SERS）基底的外泌体富集、检测系统。通过外泌体蛋白质组学分析技术,筛选可用于胰腺癌诊断的差异外泌体膜蛋白标志物。利用所构建的检测系统对差异外泌体膜蛋白进行检测,并构建联合诊断模型,初步评估其在胰腺癌诊断中的应用价值。方法:1.超速离心法进行外泌体分离,并通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）进行外泌体形态学表征。纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）测定外泌体悬液的浓度及粒径分布。蛋白免疫印迹（Western blot）分析其标志蛋白的表达。2.免疫荧光实验表征富集外泌体的功能化磁珠,并通过紫外吸收光谱分析表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,SERS）探针的合成。利用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）表征外泌体捕获体系的构建、磁珠@外泌体@SERS 检测探针复合物（Magnetic beads@exosomes@SERS detection probes,MEDP）形成、MEDP@H-SERS系统构建及不同检测基底的形态学特征。拉曼明场成像以及mapping成像表征MEDP在不同检测基底的分布;表面增强拉曼光谱表征MEDP与不同基底联合所呈现的信号强度。3.运用非标记蛋白质组学定量分析技术及数据库筛选胰腺癌与健康对照外泌体差异蛋白质。提取血清外泌体蛋白质,Western blot进一步验证差异蛋白质的表达情况。流式细胞术分析差异蛋白质在外泌体中的定位情况。4.通过采集不同标准外泌体浓度的拉曼光谱,选取能够代表外泌体含量的特征峰,根据其强度绘制外泌体检测标准曲线,并计算最低检出限（Limit of detection,LOD）。通过获取检测系统部分组分缺失实验的拉曼光谱,进行检测系统特异性分析。5.基于MEDP@H-SERS系统获取胰腺癌与健康对照外泌体差异膜蛋白的SERS信号强度,利用logistic回归分析构建多分子联合诊断模型,通过受试者工作曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）评估其对胰腺癌的诊断效能。结果:1.TEM结果显示外泌体为形状大小不一的圆形或椭圆形囊泡状颗粒。NTA结果表明外泌体的峰值浓度为1.4×107particles/mL（以1:1000的比例稀释）,最大浓度所对应的粒径为132 nm。Western blot检测显示,外泌体表达其标志蛋白CD63、CD9。以上结果表明外泌体成功分离。2.SEM图像显示CD63功能化磁珠表面吸附有100 nm左右的小囊泡,说明外泌体成功捕获。紫外吸收光谱显示最大吸收峰由410 nm红移至425 nm,证明CD9抗体成功与银纳米颗粒（AgNPs）偶联,形成CD9-SERS检测探针。捕获外泌体的磁珠与CD9-SERS检测探针共孵育,SEM图像显示CD9-MEDP形成。通过将CD9-MEDP与不同检测基底联合构建外泌体检测系统,发现MEDP@H-SERS系统能够提供最强的SERS信号强度,相比于MEDP与玻片联合的检测系统,SERS信号可提高近3.5倍。3.通过外泌体蛋白组学定量分析技术以及数据库筛选,明确LRG1和GPC1作为胰腺癌诊断的候选外泌体分子。Western blot和流式细胞术分析显示LRG1和GPC1在胰腺癌和健康对照中表达差异显著,且定位于外泌体膜表面;因此,将LRG1阳性的外泌体（LRG1-Exos）和GPC1阳性的外泌体（GPC1-Exos）作为研究对象纳入下一步研究。4.在不同标准浓度的外泌体中进行LRG1-Exos和GPC1-Exos检测,将获得的SERS信号绘制标准曲线,发现SERS信号强度在一定范围内与外泌体浓度的对数呈现很好的相关性,通过计算获得MEDP@H-SERS系统的最低LOD为15 particles/μL。5.在胰腺癌患者和健康对照血清样本中应用MEDP@H-SERS系统分别对LRG1-Exos、GPC1-Exos进行检测,结果显示其含量在胰腺癌患者中显著升高,通过绘制ROC曲线,计算曲线下面积（Area under curve,AUC）分别为0.764和0.84。使用MEDP@H-SERS系统在15例健康对照和35例胰腺癌患者中对LRG1-Exos和GPC1-Exos进行联合检测,可以进一步提高胰腺癌的诊断效能（AUC=0.95）。此外,基于MEDP@H-SERS系统的LRG1-Exos和GPC1-Exos联合检测能够区分早期胰腺癌（AUC=0.95）。结论:1.本研究构建的MEDP@H-SERS系统在胰腺癌相关外泌体检测中具有较高的检测灵敏度,为临床外泌体标志物的检测提供新方法。2.基于MEDP@H-SERS系统的LRG1-Exos和GPC1-Exos联合检测对胰腺癌有较高的诊断效能,提示其可能作为新型无创诊断标志物,具有潜在的临床应用价值。