论文部分内容阅读
吲哚美辛(indomethacin,IDM)是一种非甾体类抗炎药,在人医和兽医临床均被广泛使用。吲哚美辛的不良反应包括引起消化、神经、循环、血液等多系统的损害。欧盟已经规定了部分非甾体抗炎药的最大残留量,但尚无吲哚美辛在动物性食品中的最大残留限量以及食品动物用药后的休药期规定,而吲哚美辛价格低廉、临床应用效果好,所以易被养殖户滥用,进而造成在动物性产品中大量残留。因此,检测吲哚美辛残留对保障食品安全至关重要。目前,国内外检测吲哚美辛残留量的方法多样化,其中依靠仪器的方法如高效液相色谱法,能够快速分析沸点高、分子量大、化学性质不稳定的化学物质,缺点是处理样品复杂、不能快速得到结果、无法在现场对高通量样品进行检测。与之相比,免疫学检测法具备高通量、成本低等优势,在药物残留检测方面具有广阔的应用前景。因此,本试验旨在制备出特异性强、亲和力高的吲哚美辛单克隆抗体,然后建立快速高效的免疫学检测方法,为动物源性食品中吲哚美辛的残留检测提供理论和技术参考。1.吲哚美辛人工抗原的合成与鉴定采用碳二亚胺法合成人工抗原免疫原IDM-BSA和检测原IDM-OVA,通过紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,初步判断人工抗原偶联成功。用IDM-BSA对BALB/c小鼠常规免疫,用ELISA法测得血清抗体效价1:64 000,证明人工抗原合成有效。BCA法测得IDM-BSA的蛋白浓度为5.20 mg/mL,IDM-OVA蛋白浓度为3.26 mg/mL,紫外分光光度法测得IDM-BSA的偶联比为5.7:1,IDM-OVA的偶联比为6.2:1。2.吲哚美辛单克隆抗体的制备与鉴定将IDM-BSA作为免疫原,按照常规动物免疫方案对小鼠免疫,五免后7 d采集小鼠血清,测定其血清效价及进行药物抑制实验。选取免疫效果较好的小鼠取其脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用ELISA和CiELISA进行细胞筛选,最终得到一株可持续分泌且稳定的针对IDM单抗的杂交瘤细胞株,将其命名为5D8。采用ICR小鼠体内诱生法,收集获得腹水约10 mL。腹水经过亲和层析柱纯化,SDS-PAGE鉴定,杂蛋白明显减少,抗体效价达1:128 000。交叉实验结果表明,该单抗与美洛昔康、氟尼辛葡甲胺、卡洛芬和萘普生没有交叉反应,且对吲哚美辛的抑制率为100%。3.ELISA方法的建立利用纯化后的腹水,建立检测IDM残留的CiELISA方法。摸索出最佳封闭液为0.5%明胶,最佳包被原工作浓度为1:1500,抗体的最佳工作浓度1:16000。IDM浓度在5～10000 ng/mL时,线性关系良好,线性方程为y=0.216 5 x+0.010 9,相关系数 R2=0.993 1,单抗对 IDM 的 IC50 为 180.61 ng/mL,LOD 为 1.01 ng/mL,LOQ 为 8.77 ng/mL。4.鲜奶中吲哚美辛添加回收实验在鲜奶样品中进行添加回收实验,当鲜奶稀释16倍时,可排除基质干扰的影响。在5～10000 ng/mL范围内,线性关系良好,线性回归方程为y=0.2248 x—0.048 7(R2=0.9869),IC50 为 275.05 ng/mL,LOD 为 2.19 ng/mL,LOQ 为 40.88 ng/mL。用 50 ng/mL、500 ng/mL、2000 ng/mL三种不同浓度的IDM溶液做药物添加回收实验,检测后计算得鲜奶中吲哚美辛的添加回收率在85%～100%之间。