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CD4~+T细胞缺失和机体持续的免疫激活是HIV感染的主要免疫病理特征。病毒感染导致肠道免疫系统结构和功能的损伤、粘膜屏障破坏、微生物易位,从而导致机体慢性免疫活化,这可能是HIV-1致病的重要机制。虽然HIV感染过程中Th17细胞发生显著变化,但该细胞的缺失对免疫系统的影响尚不清楚,尤其是Th17细胞在粘膜屏障损伤中的作用亟待研究。本文应用SIV/SHIV感染恒河猴分析消化道粘膜CD4~+T Th17细胞与消化道粘膜屏障结构在病毒感染后的变化及相互关系;同时应用Caco-2细胞体外构建细胞单层,探讨SIV/SHIV蛋白组分gp160和Tat以及IL-17对上皮细胞屏障的影响,为HIV-1感染所致粘膜屏障损伤的修复提供新思路。在体内实验研究中,为了解SIV/SHIV感染对恒河猴消化道粘膜CD4~+TTh17细胞的影响,本文采用流式细胞术检测了 CD3+CD4~+T细胞、IL-17+CD3+CD4~+T细胞、IL-10+CD3+CD4~+T 细胞、Foxp3+CD3+CD4~+T 细胞、IL-4+CD3+CD4~+T 细胞和IFNy+CD3+CD4~+T细胞亚群的相对大小;并通过realtimeRT-PCR检测了IL-17A、RORyt、TGF-β、GATA-3、T-bet和Foxp3等基因mRNA表达水平在病毒感染后的变化。为了解粘膜屏障在SIV/SHIV感染后的变化,本文利用透射电子显微镜观察了正常动物和感染动物消化道粘膜上皮的超微结构,采用real time RT-PCR检测了与紧密连接相关的claudin-1,claudin-3,occludin和ZO-1基因的转录水平,应用western blot和免疫荧光染色技术检测了紧密连接相关的相关蛋白Claudin-1,Claudin-3,Occludin和ZO-1的表达水平。为验证IL-17A的保护作用,本文采用嵌入式transwell培养Caco-2细胞,体外构建细胞单层,观察了 SHIV/SIV蛋白组分gp160和Tat以及IL-17对上皮细胞屏障跨上皮细胞电阻、FITC-Dextran通透性的影响,同时应用real time RT-PCR检测了细胞单层中与紧密连接相关的claudin-1,claudin-3和ZO-1基因的转录水平。研究发现,SIV/SHIV感染动物消化道粘膜中CD3+CD4~+T细胞比例较未感染动物低;IFNγ+CD3+CD4~+T细胞和IL-4+CD3+CD4~+T细胞比例较未感染动物的高,Th1细胞和Th2细胞核转录因子T-bet和GATA-3的转录水平与未感染动物相比有不同程度的升高;在病毒感染组肠道粘膜组织中,除回肠,IL-17+CD3+CD4~+T细胞比例较正常组降低,三组感染动物消化道粘膜中IL-17的转录水平均低于正常动物;检测 IL-10+CD3+CD4~+ T 细胞和 Foxp3+CD3+CD4~+ T 细胞,SIV/SHIV感染动物除结肠Foxp3+CD3+CD4~+T细胞比例较正常动物降低,其余消化道粘膜组织中这两类细胞比例较正常动物均升高;real time RT-PCR检测Foxp3结果显示,除Gr4组空肠、盲肠和结肠Foxp3转录水平与正常动物相比较降低,另两组SHIV感染动物消化道粘膜组织中Foxp3转录水平与正常动物相比较高。在研究动物消化道上皮屏障的过程中,通过透射电子显微镜观察Gr4组和Gr19组动物小肠和大肠粘膜上皮细胞超微结构,与正常动物进行对比,可见上皮细胞间紧密连接增宽,胞间缝隙增大:微绒毛排列散乱、变细、稀疏,呈现倒伏状,有部分断裂、脱落;内质网有扩张现象,线粒体有肿胀,在胞质内有空泡出现。在基因水平,感染动物中claudin-1的转录水平较正常组均降低,直肠中Gr19组claudin-1的转录水平较正常组降低;蛋白水平,感染组动物的空肠、盲肠和结肠粘膜中Claudin-1的蛋白表达水平较正常组降低,激光共聚焦显微镜观察发现病毒感染组动物消化道粘膜组织中Claudin-1的分布和蛋白表达水平均受到影响,分布散乱、荧光度低。Claudin-3在基因水平,感染动物十二指肠和空肠claudin-3的转录水平较正常组均降低;感染动物回肠、结肠和直肠中Gr19组claudin-3的转录水平较正常组均降低;蛋白水平感染动物的空肠、结肠和直肠粘膜中Claudin-3的蛋白表达水平较正常组降低;十二指肠中Gr19组Claudin-3的表达水平较正常组升高,Gr15组降低;盲肠中Gr19组和Gr15组Claudin-3的蛋白表达水平较正常组降低。Real-time RT PCR检测发现在感染动物十二指肠、空肠和直肠occludin的转录水平较正常组均降低;western blot检测发现感染动物小肠粘膜中Occludin的蛋白表达水平均较低,结肠中Gr19组和Gr4组Occludin的蛋白表达水平较正常组降低。Real-timeRTPCR检测发现在感染动物十二指肠和空肠ZO-1的转录水平较正常组均降低;激光共聚焦显微镜观察动物消化道粘膜组织免疫荧光染色切片,发现病毒感染组动物消化道粘膜组织中ZO-1的分布和蛋白表达水平均受到影响,分布不连续、荧光度降低。在体外实验研究中发现,我们可以建立稳定的Caco-2细胞体外研究体系,Tat(14ng/ml)对细胞单层具有即时影响效应,即作用2h后会增加细胞单层通透性并降低TER;特定浓度Tat和gp1 60对Caco-2细胞单层紧密连接相关基因表达的影响不大;IL-17(100ng/ml)对细胞单层有一定程度的保护作用。综上所述,SIV/SHIV感染恒河猴消化道粘膜CD3+CD4~+ T细胞和IL-17+CD3+CD4~+T 细胞比例下降,与紧密连接相关的 claudin-1,claudin-3,occludin和ZO-1基因的转录水平以及相关蛋白的表达水平有不同程度的下降,Tat(14ng/ml)对细胞单层具有即时影响效应,IL-17(100ng/ml)对细胞单层有一定程度的保护作用,这些结果为新的治疗策略的发现、探索新的方法减少微生物易位和免疫激活提供新思路。