小苍兰是世界十大切花之一,繁殖和商品流通形式主要依赖种球,种球的质量直接影响其观赏价值和商业价值。不少研究已表明,球茎质量与内源激素和糖代谢及调控密切相关。本文以小苍兰品种‘上农黄金’为材料,在观测其球茎发育进程的基础上,分析了内源激素和糖代谢随球茎发育的动态变化,进而利用转录组分析,明确了与小苍兰球茎发育密切相关的内源激素和糖代谢途径,建立了球茎发育的差异表达谱。同时,对主要代谢途径的关键差异基因进行了表达特征分析,从分子层面揭示其球茎生长发育的调控机理。旨在为指导其球茎生产与调控实践提供科学指导。主要研究结果如下:1.首先,通过定期观测将小苍兰球茎形成进程划分为四个时期,分别:新球形成期(50~90 DAP),地上植株表现为五叶期到八叶期;球茎膨大阶段,地上植株为现蕾期到开花期,包括两个时期,即90~120DAP为增长初期,120~140 DAP为快速膨大期;最后是球茎成熟期(140~190 DAP),地上植株表现为开花末期至枯苗期。2.采用间接酶联免疫分析法(ELISA)方法,定期测定小苍兰球茎的内源激素。结果发现,GA3含量表现为双峰值“M”型趋势,2个峰值分别出现在球茎膨大前期和球茎成熟初期;ABA水平整体呈现下降趋势,最高值出现在新球形成初期,现蕾期间降到最低值后有所回升,然后再次下降;IAA的变化趋势与ABA相反,整体呈上升趋势,球茎形成期IAA波动不大且维持较低水平,球茎膨大中期时达到一个峰值后出现下降至球茎膨大后期到一低值,然后再次快速上升至球茎成熟,达到最高值;ZR含量变化则表现为多峰值“M”型趋势,3个峰值分别出现在球茎形成初期、球茎膨大后期及球茎完全成熟期。相关分析表明,除ZR与发育进程无相关性外,其它所有测定指标均显著相关,说明GA3、IAA、ABA等内源激素水平以及激素之间的动态平衡均与其球茎发育进程密切相关。3.蔗糖与淀粉的含量与小苍兰球茎发育呈现明显的正相关关系,其含量随球茎不断膨大总体表现为不断增加的趋势。蔗糖代谢途径中关键酶蔗糖磷酸合成酶(SPS)整体上呈现出先上升后下降再上升的趋势,蔗糖合成酶(Su Sy)表现为先下降后上升再下降的趋势;而转化酶(INV)则整体上呈现先上升后下降的趋势。测定淀粉代谢途径3个关键酶的动态变化发现,淀粉酶整体上呈现出先上升后下降再上升的趋势,Q酶和ADPG焦磷酸化酶的活性整体上则呈现出持续上升的趋势,与淀粉含量变化呈现正相关关系。4.以小苍兰不同发育阶段的球茎为材料进行了转录组重测序,构建了12个c DNA文库,测序共获得82.54Gb Clean Data,其Q30碱基百分比均高于89%,GC%约为48%。组装后共得到100,999条unigene,其N50为1,507,平均长度约为772 nt,组装完整性较高。在NR、Pfam等数据库中注释到了44,405条,约占总unigene的44%。通过COG和GO数据库进行功能分析,发现参与碳水化合物代谢功能以及次生代谢过程的注释基因比较集中。利用MISA软件,在小苍兰‘上农黄金’球茎中共鉴定出6种类型的SSR,对筛选得到的1kb以上的Unigene做分析后共得到9,200个SSR位点,其中单碱基重复最常见,占总数的48.5%。5.内参基因对利用荧光实时定量PCR分析目的基因表达的准确性影响很大。我们从上述转录组中选择了8个传统持家基因开展了内参基因的筛选,并通过Best Keeper、Norm Finder以及ge Norm综合分析其表达的稳定性。结果表明:在小苍兰球茎的四个发育时期中,QCR、Actin、TUB的表达是最为稳定的,适宜作为内参基因,CYP和18sr RNA最不稳定;而在六个组织器官中,Actin和18sr RNA是最合适的内参基因。GAPDH、β-Tubulin和SAMDC的稳定性在不同软件分析中结果存在一定差异,稳定性适中,而EF-1β最不最不稳定。6.构建了小苍兰球茎发育差异表达基因(DEG)数字基因表达谱,进一步通过q PCR研究了关键差异基因的表达模式。比较差异表达基因的分布,发现快速膨大期与成熟期对比得到的DEG最多且主要为下调基因,可见这两个时期是小苍兰球茎发育活动最为活跃的时期。基于KEGG的通路分析表明,小苍兰球茎发育相关DEG参与的代谢通路达20个以上,蔗糖-淀粉代谢和激素代谢活跃。功能富集分析表明,DEG主要集中在代谢过程和发育过程等,除了基础生命活动的功能,球茎发育期间碳水化合物代谢居于第二位,代谢活动非常活跃。根据关键酶基因的FPKM值,构建了小苍兰球茎中内源激素与糖代谢的主要调控模式图。通过q PCR分析激素与糖代谢的关键酶基因表达模式,发现,α-葡萄糖苷酶基因在球茎成熟期表达量骤增,INV和Su Sy的基因表达量均在快速膨大期达到最高,Su Sy在开始形成期和增长初期相对表达较高,随后下降。Q酶在球茎发育前三个阶段表达量均较低,至成熟期则大量表达;ADPG焦磷酸化酶的表达随球茎发育而升高;β淀粉酶表达在前三个发育阶段呈现急剧增加趋势,但到成熟期则下降。ZR合成途径中关键酶细胞分裂素反式羟化酶在增长初期表达量最高;ABA代谢途径中关键酶脱落酸8’-羟化酶在成熟期的表达量最低,而合成途径前期的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的表达量则最高;GA和IAA代谢途径中的关键酶赤霉素-20-氧化酶和细胞分裂素脱氢酶的表达量在球茎开始形成期最高。推测ZR、GA和IAA促进小苍兰球茎形态建成,而ABA可能对促进球茎成熟有积极调控意义。