胰腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,在发达国家和男性中发病率较高,诊断的中位年龄是71岁。五年生存率不足5%,在发达国家中的死亡率排在所有肿瘤中死亡率的第四位,并且逐年升高。在我国近年来发病率逐渐上升,每年近10万患者死于该疾病。虽然其发病率低于肝癌、肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤,但其恶性程度高,发病率与死亡率几乎相等。胰腺癌流行病学病因包括遗传、肥胖、饮酒、吸烟、慢性胰腺炎等危险因素。胰腺癌缺乏早期的诊断标记,常用的标记物糖链抗原19-9缺乏特异性和敏感性。胰腺的位置较隐匿,导致胰腺癌早期症状不明显,在多数患者就诊时已是中晚期或出现局部转移,失去治疗最佳时机。胰腺癌具有高度的侵袭性,对放化疗不敏感,缺乏特定的肿瘤标记物,治疗方式单一,以手术切除最为有效,但即使是接受手术的这部分患者五年生存率也只有20%。近年来,随着研究的深入,在胰腺癌的治疗方面也取得了一些进展,靶向药物也逐渐应用于临床。然而,这些药物对胰腺癌的总体生存时间却没有显著提高。因此,研究胰腺癌的病因,寻找胰腺癌早期诊断标记物和治疗新靶点是亟待解决的问题。粒状头样2(Grainyhead-like 2,grhl2)基因是果蝇grh基因在哺乳动物中的同源基因之一,能够作为转录因子调控肠内胚层和表皮外胚层上皮细胞的分化。grhl2不仅在发育过程中与神经管闭合、上皮完整、表皮损伤修复和听觉损伤有关,还可通过调节紧密连接来增强肺泡上皮的完整性,或使肺上皮细胞纤维化从而导致先天性特发性肺纤维化的发生。grhl2在不同肿瘤中的表达模式和功能存在很大差异。在乳腺癌中,grhl2作为癌基因,可以通过抑制死亡受体的发生从而促进肿瘤细胞抗失巢凋亡,同时上调ErbB3等致癌基因来促进癌细胞增殖;在结直肠癌中,grhl2是低生存率和低无复发生存的独立预后危险因素;在口腔鳞状细胞癌中,grhl2通过抑制人端粒逆转录酶的活化,从而促进肿瘤细胞增殖。而当grhl2作为抑癌基因时,可以在胃癌细胞中通过抑制TGF-β信号通路来逆转EMT的发生,在卵巢癌细胞中通过miR-200b/a间接抑制zeb1的表达从而维持细胞上皮表型,在乳腺癌细胞中通过抑制zeb1的启动子来抑制EMT的发生。GRHL2在不同肿瘤中的作用机制不尽相同,文献中缺乏GRHL2与胰腺癌的相关性研究,鉴于此,本研究第一部分拟对胰腺癌临床样本中GRHL2的表达水平进行检测并分析其与临床病理资料间的关系;第二部分结合体内外实验对GRHL2在胰腺癌生物学行为中的作用进行研究;第三部分运用高通量测序方法检测与GRHL2调控相关的靶分子,并分析其可能的作用及机制;第四部分检测胰腺癌细胞和组织中GRHL2基因CpG岛区甲基化状态,分析其意义。目的:研究GRHL2在胰腺癌临床样本中的表达水平并分析GRHL2表达与临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,探讨GRHL2表达对胰腺癌生物学行为的影响,筛选过表达GRHL2后影响胰腺癌细胞生物学功能的靶基因。检测胰腺癌细胞和组织中grhl2基因CpG岛区甲基化状态,探讨其意义。方法:(1)收集胰腺癌患者肿瘤组织及其对应的癌旁组织,采用qRT-PCR、Western Blot、免疫组化等方式从mRNA和蛋白水平分别检测样本中的GRHL2的表达情况,分析GRHL2的表达与患者临床病理参数之间相关性。(2)构建过表达和干扰GRHL2表达的慢病毒并转染至胰腺癌细胞,筛选稳转细胞株并从mRNA和蛋白水平进行验证。对稳转细胞株进行生物学功能实验:利用CCK-8检测胰腺癌细胞的增殖能力,克隆形成实验检测单个胰腺癌细胞体外增殖能力,Transwell小室和划痕实验检测胰腺癌细胞迁移、侵袭能力,流式细胞仪检测胰腺癌细胞周期分布。利用Western Blot检测转染后胰腺癌细胞EMT标志蛋白的表达情况。利用裸鼠胰腺原位成瘤实验检测转染后细胞体内增殖和转移能力。采用脾脏和尾静脉注射胰腺癌细胞检测转染后细胞在体内的转移和侵袭能力。(3)对过表达GRHL2及其阴性对照组PANC-1细胞进行转录组测序,并利用生物信息学进行分析。分析内容包括:差异表达基因分析、差异表达基因GO分析、差异表达基因KEGG富集分析、可变剪切分析、SNP/INDEL分析。再提取过表达GRHL2及其阴性对照组PANC-1细胞的RNA,利用qRT-PCR验证筛选出的差异表达基因,并分析其意义。(4)检测19例胰腺癌肿瘤组织及其癌旁组织中的甲基化频率,分析其临床意义。再利用不同浓度甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC对胰腺癌细胞株进行处理,检测其grhl2表达水平的变化。结果:(1)qRT-PCR结果显示在胰腺癌组织中GRHL2mRNA的表达水平低于其癌旁对照组织(p<0.05)。Western Blot结果显示在胰腺癌组织中GRHL2蛋白的相对表达水平低于其癌旁对照组织(p<0.01)。通过免疫组化对89例胰腺癌及其癌旁组织中GRHL2蛋白表达情况进行分析,发现GRHL2在59.56%的胰腺癌组织呈低表达,35.96%呈高表达,而在与其对应的癌旁组织中,30.34%呈低表达,69.66%呈高表达,GRHL2在胰腺导管腺癌与其对应的癌旁组织之间的表达差异具有统计学意义(p<0.01)。GRHL2的低表达水平与胰腺癌患者的肿瘤大小(p<0.01)、浸润深度(p<0.05)、TNM分期(p<0.01)相关呈正相关性,且GRHL2低表达的患者总体生存时间较高表达患者短(12.01±0.80 vs.19.07±1.20,p=0.002)。GRHL2表达与胰腺癌的肿瘤发生部位(p=0.001)、组织分化程度(p=0.022)、Ki67阳性细胞比例(p<0.05)具有相关性。(2)稳转过表达GRHL2的胰腺癌细胞株PANC-1和敲减GRHL2的胰腺癌细胞株BxPC-3经qRT-PCR和Western Blot鉴定转染有效。生长曲线显示,过表达GRHL2的增殖能力受到抑制,而敲减组细胞生长未受影响。克隆形成实验显示,过表达GRHL2的PANC-1细胞单个细胞克隆能力受到抑制,而敲减组与其空载体间无显著差异。Transwell小室迁移实验及细胞划痕实验显示过表达GRHL2抑制细胞的迁移能力,敲减GRHL2对细胞的迁移能力无影响。Tranwell侵袭实验显示过表达及敲减GRHL2未对细胞的侵袭能力产生影响。细胞周期实验显示过表达GRHL2引起细胞S期阻滞,而敲除GRHL2对细胞周期分布无影响。过表达GRHL2后能够显著增加上皮标记蛋白E-cad的表达水平,同时降低间质标记蛋白N-cad和Zeb1的表达水平。裸鼠胰腺原位成瘤实验结果显示,过表达GRHL2组成瘤体积较其对照组小(p<0.01),过表达组未出现脾脏播散肿瘤而其对照组出现4/6(66.67%)的脾脏播散。裸鼠脾脏注射肿瘤细胞自发肝转移模型结果显示,在阴性对照组脾脏成瘤率1/6(16.67%)高于过表达GRHL2组0/6(0%),阴性对照组肝脏成瘤率5/6(83.33%)高于过表达组2/6(33.33%)。裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞转移模型结果显示,阴性对照组出现脊髓转移率5/6(83.33%)高于过表达GRHL2组1/6(16.67%),阴性对照组肺转移率4/6(66.67%)高于过表达GRHL2组0/6(0%)。(3)通过对过表达GRHL2及其阴性对照组PANC-1细胞转录组测序,筛选出显著差异性表达基因364个。其中上调差异基因313个,下调差异基因51个。GO分析显示,较多的基因参与上皮调控、细胞间粘附,在分子功能方面,差异表达基因主要参与酶功能调节、分子信号转导等。KEGG分析显示,较多的差异表达基因参与鞘脂类生物合成、紧密连接、粘着斑等相关途径。在过表达GRHL2及其阴性对照组PANC-1细胞中,LAMB3、LAMC2、OVOL1、PRSS8、PVRL4、RAB25、TJP3、ErbB3、CDH1基因的差异表达趋势与转录组测序结果一致。(4)胰腺癌组织中GRHL2启动子区甲基化频率显著高于癌旁组织(p<0.001),甲基转移酶抑制剂处理胰腺癌细胞株后可使GRHL2表达重现(p<0.001)。结论:(1)GRHL2在胰腺癌中相对于其癌旁组织呈低表达,GRHL2的低表达患者总体生存期较短,预后较差,且与胰腺癌的发病部位、分化程度和Ki67指数相关。(2)PANC-1细胞中过表达GRHL2可以抑制体外细胞的增殖、迁移能力。过表达GRHL2促使上皮表型蛋白上调,间质表型蛋白下调。GRHL2过表达抑制体内肿瘤生长和转移。(3)GRHL2的表达与胰腺癌细胞中上皮表型维持、细胞间紧密连接、细胞间粘附等相关基因最为密切。(4)胰腺癌中GRHL2的下调与GRHL2启动子区甲基化密切相关,GRHL2启动子区甲基化是调控其功能的重要机制。