蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是细胞正常生命活动调控的重要方式之一，其磷酸化水平受酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)的双相调节，通过它们的协同作用维持蛋白质酪氨酸磷酸化的平衡，从而保证细胞的生长、代谢、迁移、增殖和分化等一系列重要生命活动的正常进行。由于许多PTKs是癌基因或生长因子受体，因此已得到了广泛的研究，但PTPs的重要性直到近些年来才得到充分的认识。 PCP-2基因由第二军医大学王红阳教授于1996年首先克隆并鉴定，其结构与PTPμ和PTPκ高度同源，同属受体型酪氨酸磷酸酶(RPTPs)Ⅱb亚家族。与其它RPTPs不同的是，上述三者胞外区具有一个MAM(meprin／A5／PTPμ)功能域和胞内较长的近膜区。现已证实MAM功能域参与PTPμ和PTPκ介导的非钙离子依赖的同源性粘附；而胞内近膜区含有与细胞粘附分子钙依赖性粘附素(E-cadherin)同源的结构域，通过该结构使胞内区与β-连环蛋白(β-catenin)结合，后者通过结合α-连环蛋白(α-catenin)与细胞骨架相联系。第四军医大学硕士学位论文日一catenin是一种具有双重功能的蛋白质，它一方面参与细胞粘附，对细胞骨架发挥功能具有重要作用;另一方面又是Wnt途径的效应分子，与转录因子LEFI/TCF4结合后激活下游基因(c一myc，CyclinDI等)表达，在发育和肿瘤发生中占有重要地位，是目前生物学研究的热点问题之一。 越来越多的证据表明可逆的酪氨酸磷酸化是调节E一cadherin/p一eatenin复合体的粘附功能及旦一eatenin转录活性的重要机制。但目前国际上对RPTPs调控该复合体的研究较少，尤其是对日一catenin转录功能的调节尚无报道。前期研究发现PCP一2与该复合体共同定位于细胞联结部位，提示PCP~2可能参与对其功能的调控。本研究旨在通过对PCP理与该复合体相互作用的研究，阐明PCP一2对细胞粘附和p一。atenin转录活性的影响，为进一步揭示其在肿瘤发生中的作用机制提供线索，并探讨其潜在的应用价值。 本实验应用RT一PCR及重组PCR技术获得了p一catenin不同功能区缺失基因融合或不融合GFP基因的真核表达载体。运用共转染技术和荧光素酶报告基因系统检测PCP一2及RPTPllb家族成员PT即和PTPK对p一catenin转录活性的调节作用，并在此基础上进一步检测了目一catenin转录调控下游基因表达的变化。而后，建立了稳定表达PCP一2的肿瘤细胞株，使用免疫印迹、免疫共沉淀及荧光素酶报告基因系统检测了这种建株细胞中p一catenin转录活性的变化和受p一catenin调控的下游基因表达的改变。运用间接免疫荧光和免疫沉淀技术观察了p一catenin在建系细胞中的亚细胞定位及酪氨酸磷酸化状态的改变;并运用免疫沉淀和免疫印迹方法观察了PCP一2与E一cadherin/p一catenin复合体的相互作用;应用免疫沉淀、GST Pundown以及免疫荧光技术研究陀P一2对E一cadherin/p一caten加复合体稳定性的调节;通过细胞增殖实验、划痕实验和集落形成实验等检测了PCP一2稳定表达对细胞粘附、迁移、生长和增殖的影响;通过裸鼠成瘤实验观察稳定转染pCP一2对第四军医大学硕士学位论文肿瘤细胞SW48O成瘤性的影响。 实验结果显示:PCP一2能够与p一catenin特异性结合，并且由p一eatenin梭基末端介导;PCP一2可以下调日一eatenin转录活性，该作用依赖于PCP一2磷酸酶活性结构域和胞内近膜区结构;PCP一2稳定转染SW48O细胞后可显著抑制细胞的迁移、增殖及集落形成能力:对稳定表达PCP一2的SW480细胞株进一步的研究发现其p一catenin转录活性下调，E一 cadherin表达水平升高而游离的p一eatenin减少，E一eadherin/p一eatenin复合体稳定性提高，并伴随p一catenin酪氨酸磷酸化水平的下降;裸鼠成瘤实验显示该细胞株成瘤能力显著减弱。 本研究首次发现受体型酪氨酸磷酸酶PCP一与重要的肿瘤相关蛋白p一eatenin相互作用，并证实PCP一2既可以与p一eatenin发生直接结合，也可通过调节其酪氨酸磷酸化水平间接提高E一cadherin/p一catenin复合体稳定性，从而促进细胞间粘附，降低p一catenin转录活性，实现其抑制细胞迁移，增殖和转化的能力。 本研究首次证实了受体型酪氨酸磷酸酶PCP一2与p一catenin的相互作用不仅抑制了日一catenin的转录活性和促转化能力，而且促进细胞间粘附并抑制细胞迁移，从而发挥抑癌作用。说明受体型酪氨酸磷酸酶在细胞间粘附及细胞内信号转导作用中发挥了重要的调节作用，建立了肿瘤相关蛋白日一catenin在细胞间粘附及细胞内信号转导中调控的联系，为进一步研究信号转导与细胞功能发挥之间的关系提供了实验依据。