肾脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury，IRI）是临床上一种常见的病理生理过程，在急慢性肾衰、移植后排斥反应等的发病中具有重要作用，目前尚无有效的干预方法。　　 内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种具有定向归巢、自我更新、增殖分化特性的多能干细胞，在体内可募集、归巢到血管或组织损伤部位，通过分泌血管生成因子以及分化机制，参与损伤脏器血管新生以及组织修复等，从而减轻器官的IRI，达保护脏器的目的。　　 本研究通过建立大鼠急性IRI模型，EPCs移植，观察EPCs在IRI肾脏的归巢情况及其对肾脏的保护作用，并从旁分泌机制探索EPCs移植对IRI肾脏血管新生因子的影响。　　 第一部分大鼠骨髓源性EPCs的提取、体外诱导培养和鉴定　　 目的：获取特异、稳定、足量的大鼠骨髓源性EPCs，为下一步实验研究作准备。　　 方法：Ficoll密度梯度离心法获取SD大鼠骨髓源性单个核细胞，体外加入诱导培养基EGM-2MV（含5％胎牛血清、VEGF10μg/L、bFGF2μg/L、EGF5μg/L）中，37℃温箱中培养。（CD31、Ⅷ因子、CD34）免疫组织化学染色鉴定EPCs表面标志，联合FITC-UEA-1表面附着、Dil-acLDL内吞实验进一步鉴定EPCs及细胞活力。　　 结果：培养细胞呈现EPCs特有的条索状和铺路石状，细胞生长稳定，3d时即可良好贴壁，培养10d时细胞形态规整；经CD31免疫组化染色鉴定，显示EPCs表面CD31、Ⅷ因子、CD34表达阳性率分别为76±4.83％、71±5.55％和72±5.45％；FITC-LJEA-1表面附着、Dil-acLDL内吞实验显示细胞活力良好。　　 结论：利用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞，体外诱导培养EPCs简单可行，培养的细胞可充分表达EPCs表面标志，并具有EPCs的功能特征。　　 关键词：内皮祖细胞、培养、鉴定、表面标志；　　 第二部分：EPC移植治疗对肾脏IRI的保护作用观察　　 目的：建立大鼠肾脏急性IRI模型，观察EPCs移植对急性IRI肾脏的保护作用。　　 方法：9只成年雄性SD大鼠，体重180±20g，分如下几组进行研究（n=3）：①假手术组（sham组）：腹部正中切口，分离左肾动、静脉后关腹；②缺血再灌注组（IRI组）：腹部正中切口，分离左肾动、静脉后，利用血管钳同时夹闭肾脏动、静脉25min后关腹：③EPCs移植组（EPCs组）：按照②建立大鼠肾脏IRI模型后，从大鼠股静脉注射EPCs混悬液（1×106个）。模型制作成功后，分别于术后24h、72h抽取大鼠外周血；术后72h，处死大鼠，留取缺血肾脏组织，一分为四，两份采用多聚甲醛固定，行HE染色和CD34免疫组化染色，另两份新鲜组织标本送-80℃冰箱保存，检测VEGF mRNA和蛋白表达水平。　　 结果：①术后24h，大鼠外周血BUN表达水平，IRI组、EPCs移植组较sham组均明显升高（P<0.05）；术后72h时，IRI组较sham组差异仍存在，EPCs移植组与sham组差异消失。术后24h，大鼠外周血Cr表达水平，EPCs移植组较sham组、IRI组差异有统计学意义；术后72h，EPCs移植组Cr下降明显（P<0.05）。②HE染色，sham组肾脏组织微结构完整，形态正常，IRI组肾脏病理损伤程度较重，EPCs移植组肾脏病理损伤程度优于IRI组。③术后72h，缺血肾组织中CD34多表达于肾脏血管内皮细胞胞膜上，其中EPCs移植组CD34+细胞数目明显增多。④术后72h，缺血肾组织中VEGFmRNA表达水平，EPCs移植组最高，分别是sham组、IRI组的1.25倍和1.62倍；此结果与蛋白水平检测情况相仿（P<0.05）。　　 结论：通过夹闭大鼠肾蒂的方法，可成功制作大鼠急性IRI模型。EPCs参与了肾脏IRI后损伤血管内皮的的修复和重建，外源性EPCs移植可促进IRI肾脏功能恢复。EPCs对损伤血管内皮的修复可能与其定向归巢到缺血肾组织，释放VEGF有关。