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弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)是指头部在特殊外力作用下,导致以髓鞘脱失和轴索迟发断裂为主要病理特征的一种创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)。关于DAI中轴索断裂的机制,现在普遍认为,是剪应力作用后继发的复杂的病理生理变化导致的结果。研究表明,脱髓鞘会剥夺髓磷脂对轴索的能量底物供给,且TBI后葡萄糖代谢障碍会进一步加剧轴索能量来源不足。据此我们推测,能量缺陷可能是导致轴索继发损伤的重要原因。生酮饮食(Ketogenic diet,KD)能够提供能量代谢底物单羧酸,通过单羧酸转运体2(monocarboxylic acid transporter 2,MCT2)被轴索摄取利用。鉴于此,本研究拟建立DAI动物模型,从髓鞘-轴索功能单元层面来探讨生酮饮食对DAI的保护作用。成年雄性SD大鼠176只随机分为3组,分别为空白组(不进行外力打击,标准饮食,n=16),DAI+标准饮食组(DAI+SD,n=80),DAI+生酮饮食组(DAI+KD,n=80)。参照Marmarou方式建立DAI模型,术后分别给予标准饮食和生酮饮食,选取脑干上端为观察部位。利用酶联免疫法检测大鼠心血脂肪酸代谢水平和大鼠脑部能量代谢产物的变化;通过固蓝染色(luxol fast blue,LFB)和检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达变化来评估髓鞘病变;采用蛋白免疫印迹法检测β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)及磷酸化高分子量神经微丝蛋白(phosphorylated high molecular weight neurofilament subunit,p-NF-H)表达来评价轴索损伤;透射电镜进一步观察轴索和髓鞘的微观结构以及线粒体形态学变化;最后检测动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、线粒体融合素基因2(mitofusin2,Mfn2)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,mt TFA)蛋白,监测线粒体质量控制。实验结果显示:(1)与DAI+SD组相比,DAI+KD组干预3d内,大鼠心血脂肪酸、总胆固醇TC、甘油三酯TG和游离脂肪酸FFA水平显著升高;KD干预诱导DAI大鼠血浆酮体β-羟丁酸(βHB)水平持续升高,在2w时达到高峰;与DAI+SD组相比,DAI+KD组大鼠血糖水平于损伤后3d,1w和2w显著下降,且体重明显减轻。(2)大鼠脑部能量代谢产物ATP和ADP含量自DAI损伤后第1d起显著下降,并随损伤时间的延长进一步下降,NAD~+水平于DAI损伤后第3d,1w和2w显著低于空白组;与DAI+SD组相比,DAI+KD组大鼠ATP,ADP和NAD~+水平于DAI损伤后3d即明显增加,AMP,NADP~+和NADPH的变化无统计学意义。(3)LFB染色和MBP免疫组织化学染色结果显示,DAI损伤后3d和1w脑干区域髓鞘平均光密度显著减弱,髓鞘脱失严重。MBP免疫印迹结果进一步证实DAI后2d至2w内MBP表达较空白组显著减少。与DAI+SD组相比,DAI+KD组大鼠LFB染色强度和MBP蛋白表达水平显著升高。(4)DAI后2w内APP显著上调,并在第3d达到高峰。p-NF-H于DAI损伤后3d,1w和2w显著增加。与DAI+SD组相比,KD干预显著降低APP和p-NF-H蛋白水平。(5)透射电镜结果显示,空白组大鼠脑干髓鞘致密,轴浆内微管微丝等细胞骨架排列整齐。DAI+SD组大鼠损伤后1d髓鞘出现局灶性结构紊乱;DAI后3d髓鞘板层结构分离,内外突出压迫轴浆内容物或周围组织结构,髓鞘内层与轴膜局部分离,但轴浆内微管微丝结构尚保持完整。DAI后1w髓鞘广泛空壳样改变,局部断裂,轴索变性呈空白透亮区。DAI后2w,大部分髓鞘-轴索单元变性甚至溶解消失,部分残存髓鞘厚度明显变薄。KD干预明显改善了髓鞘及轴索超微结构,表现为轴索变性明显减轻,g-ratio示髓鞘变厚。对线粒体的形态进行观察,DAI+SD组的轴索内线粒体数量明显增多,形态多为小而圆的线粒体;而DAI+KD组大鼠则显示较高比例的长管状线粒体。(6)线粒体质量控制指标的变化:线粒体分裂指标DRP1于DAI损伤后3d和1w表达显著增加,KD干预显著降低其蛋白水平;与DAI+SD组相比,DAI+KD组大鼠的线粒体融合指标Mfn2蛋白水平于损伤后3d,1w和2w显著升高;与空白组相比,DAI+SD组大鼠的线粒体生物合成指标NRF1蛋白水平于损伤后3d,1w和2w显著升高,mt TFA仅在伤后3d出现显著增加,而KD干预未见NRF1和mt TFA蛋白水平明显变化。以上研究结果表明,生酮饮食诱导DAI大鼠的高酮体代谢,显著提高大鼠脑部能量供给,抑制轴索内线粒体的碎片化而增强线粒体融合,保护髓鞘-轴索单元的完整性。本研究揭示DAI发病的能量代谢机制,为DAI的防治提供新思路和新靶点。