牛泰勒虫病是由泰勒属的泰勒虫寄生于牛的红细胞和网状内皮细胞所引起的血液原虫病,病牛表现为发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大,严重的引起死亡。在牛泰勒虫病的病原中,小泰勒虫和环形泰勒虫是致病性最强、危害最为严重的两种病原。由小泰勒虫引起的牛泰勒虫病又称为东海岸热,主要分布于非洲,目前我国并未发现有小泰勒虫感染。环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫是我国已报道的牛泰勒虫病病原。本实验室的前期工作发现,主要梨形虫表面蛋白MPSP能够与三种泰勒虫的阳性血清发生强烈反应,可以作为同时检测牛泰勒虫病的通用抗原,本研究在此研究的基础上,表达了中华泰勒虫MPSP蛋白,并制备了相应的兔源性多克隆抗体,建立了牛泰勒虫病试纸条快速诊断技术。主要研究内容如下:根据已发表的序列设计合成引物,PCR扩增得到了中华泰勒虫MPSP基因,构建pET-28a(+)重组质粒,转入大肠杆菌表达系统中诱导表达,并纯化该重组蛋白,对其反应原性进行分析。Western-Blot分析结果表明,MPSP蛋白能够与环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫等3种牛泰勒虫阳性血清反应,但与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫及大巴贝斯虫阳性血清及无梨形虫感染的牛阴性血清无交叉反应,说明该蛋白种属特异性较好,可作为泰勒虫属疾病的诊断抗原。用MPSP蛋白分三次(0 d,14 d和28 d),每次以100μg/只的剂量免疫三只健康的新西兰大白兔(免疫前采集阴性血清),三免10天后进行心脏取血,采用酶联免疫吸附试验测定血清抗体的效价,得到的三只家兔的血清抗体效价分别为1∶25600、1∶12800、1∶12800。采用Protein A法从血清中纯化抗体并对其进行SDS-PAGE电泳分析,经考马斯亮蓝染色后可以清晰的看到轻链与重链两条带。利用纯化的蛋白及相应抗体制备了牛泰勒虫病的免疫胶体金试纸条快速诊断技术。试纸条的硝酸纤维素膜上分别以抗原和多克隆抗体作为检测线和质控线;以胶体金标记的MPSP蛋白金标抗原,并喷涂于玻璃纤维纸上成为胶体金垫。将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组装于PVC板上,切成2.5 mm的条状,制成胶体金试纸条成品。制成的该试纸条特异性良好,操作简便快捷,20 min即可完成样品检测。通过性能评价,结果显示,该方法可检出牛感染泰勒虫后第3周至第15周针对MPSP的抗体,表明该试纸条可以用于牛泰勒虫病的诊断。采用所建立的rMPSP牛泰勒虫免疫胶体金试纸条对采自甘南藏族自治州的80份血清样品进行了诊断,并与本实验室已经建立的rMPSP-ELISA方法进行比较。结果显示,免疫胶体金试纸条和rMPSP-ELISA检测的阳性率分别为65%和72.5%,且两种方法的强阳性符合率和阴性符合率均为100%,弱阳性符合率为83.3%,表明该胶体金试纸条具有较好的特异性,敏感性较ELISA方法略差,但免疫胶体金试纸条具有操作简便、速度快、结果可观、适用于野外现场诊断等优点,故可以作为一种牛泰勒虫病的新型诊断工具。综上所述,本研究建立了基于rMPSP的牛泰勒虫病的免疫胶体金试纸条诊断技术,为牛泰勒虫病的流行病学调查提供了一种新的检测方法。