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椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是导致腰背部疼痛以及劳动力丧失的常见原因,给患者及社会造成了巨大的精神和经济负担。椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板组成。IDD时,髓核区域较早出现退行性改变,并引发级联反应导致病变不断加剧。髓核退变以髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的减少为主要特征,而NPCs是ECM的主要来源。NPCs数量减少的病理生理学机制尚未完全明了,探索不同应激状态下NPCs死亡的病理机制有利于寻找治疗IDD的新靶点。焦亡(pyroptosis)是近年来新发现的一种细胞死亡形式,其与凋亡在分子机制及细胞形态变化上均有着显著的差别。氧化应激是诱导椎间盘NPCs衰老和自噬的常见因素,并且随着退变程度的增加,椎间盘髓核组织中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的含量也有所增加。但ROS能否诱导人退变椎间盘NPCs发生焦亡,以及其对NPCs焦亡的调控机制尚未阐明。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 like 2,NFE2L2)是NPCs中的一种转录因子,调控NPCs内多种蛋白质的转录和翻译,并随着椎间盘退变程度的加重而表达减少,然而其在NPCs焦亡中的作用也尚无报道。本课题拟从焦亡相关信号蛋白在人退变椎间盘NPCs中的表达情况,ROS通过Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLR family pyrin domain containing 3,NLRP3)/含PYD和CARD域蛋白(PYD and CARD domain containing,PYCARD)信号轴激活caspase-1(CASP1)介导NPCs焦亡;ROS增强了退变NPCs的自噬,自噬负向调节NPCs焦亡;退变NPCs内转录因子NFE2L2负向调节ROS诱导的NPCs焦亡,来阐明ROS对人退变椎间盘NPCs焦亡的影响及其调控机制。第一部分ROS通过NLRP3/PYCARD信号轴介导人退变椎间盘NPCs发生焦亡目的:探讨ROS是否通过NLRP3/PYCARD途径诱导退变椎间盘NPCs焦亡方法:签署知情同意书后,从接受经皮椎间孔镜下髓核摘除术(percutaneous transforaminal endoscopic discectomy,PTED)治疗的IDD患者获取髓核组织。取部分组织行免疫组化来检测CASP1表达情况。用酶序贯消化法从退变髓核组织中提取并培养人NPCs,用RT-qPCR和免疫荧光技术检测CD24、II型胶原(collagen type II,COL2A1)和蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)的表达来鉴定NPCs。用蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测IV和V级IDD患者来源NPCs内活性CASP1(p20),活性白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和活性IL-18的表达量。用流式细胞学技术检测不同处理后的NPCs胞内ROS含量及Hochest33342/PI双荧光染色后PI阳性细胞数,用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测相应处理后NPCs的细胞活力。用WB检测不同浓度双氧水干预下焦亡相关蛋白NLRP3、PYCARD、p20、活性IL-1β和活性IL-18的表达情况。用Hochest33342/PI双荧光染色或扫描电镜来观察NPCs细胞膜孔隙形成及破损情况。予以N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cystein,NAC)预处理抑制双氧水处理组NPCs胞内ROS的生成或予以短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)抑制NPCs胞内NLRP3或PYCARD的表达后再予以双氧水干预,检测焦亡相关蛋白及PI阳性细胞数来评估NPCs的焦亡情况。结果:退变髓核组织的NPCs中阳性表达CASP1。提取的NPCs阳性表达CD24、COL2A1和ACAN。相比于IV级退变椎间盘的NPCs,V级退变椎间盘的NPCs中ROS的水平较高,p20、活性IL-1β和活性IL-18的表达量也较高。CCK-8结果表明,当双氧水的干预浓度达到200μM及以上时,NPCs细胞活力显著下降。与对照组相比,200μM双氧水处理3h组NPCs胞内的ROS水平、PI阳性细胞数和焦亡相关信号蛋白均显著升高。经Hochest33342/PI双荧光染色及扫描电镜观察发现,经双氧水处理后PI阳性NPCs比例明显升高,细胞膜表面的球状凸起及孔洞形成明显增加。予以NAC预处理可以有效抑制双氧水处理后NPCs胞内ROS水平、焦亡相关蛋白和PI阳性细胞比例的升高。当用shRNA抑制NLRP3或者PYCARD的翻译表达时,同样可以有效抑制双氧水处理组NPCs焦亡相关蛋白和PI阳性细胞数的升高。结论:ROS可以通过NLRP3/PYCARD信号轴诱导人退变椎间盘NPCs焦亡。第二部分自噬对ROS诱导的人退变椎间盘NPCs焦亡的保护作用目的:探讨自噬在ROS诱导NPCs焦亡中的作用。方法:用WB检测空白对照组及双氧水处理组NPCs胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)和死骨片1(sequestosome1,SQSTM1)的表达情况。用CCK-8实验检测用不同浓度的雷帕霉素(rapamycin,RAP)预处理时,双氧水(200μM,3h)对NPCs活力的影响。予以500n M的RAP或10m M的3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)预处理NPCs后再给与200μM双氧水干预3h,然后用WB检测自噬相关蛋白SQSTM1、LC3和焦亡相关蛋白p20、活性IL-18、活性IL-1β的表达,用Hochest33342/PI检测PI阳性NPCs细胞比例。结果:经200μM双氧水处理3h后,NPCs胞内焦亡相关蛋白和LC3-II的表达量均显著增加,而SQSTM1显著下降(p<0.05)。CCK-8结果表明RAP能缓解双氧水对NPCs细胞活力的抑制作用。500n M RAP预处理可以显著上调NPCs内LC3-II和下调SQSTM1,并抑制双氧水诱导的焦亡相关蛋白的升高和PI阳性细胞数的增加。而10m M的3-MA预处理得到的效果正好相反。结论:ROS增加了NPCs的自噬水平,自噬负向调节ROS诱导的焦亡。第三部分转录因子NFE2L2负向调节ROS诱导的人退变椎间盘NPCs焦亡目的:探讨转录因子NFE2L2对ROS诱导的NPCs焦亡的影响。方法:用CCK-8检测不同浓度的NFE2L2特异抑制剂ML385、褪黑素(melatonin)、褪黑素受体阻断剂(luzindole)对NPCs活力的影响,从而挑选合适的干预浓度。用WB检测空白对照组、单纯双氧水处理组(200μM,3h)、ML385预处理联合双氧水处理组、褪黑素预处理联合双氧水处理组、luzindole与褪黑素预处理联合双氧水处理组、ML385与褪黑素预处理联合双氧水处理组内焦亡相关蛋白和转录因子NFE2L2的表达情况。再用Hochest33342/PI双荧光染色检测各处理组NPCs中PI阳性的NPCs比例。结果:当予以双氧水处理时,ROS上调了NPCs胞内转录因子NFE2L2的表达水平。ML385预处理可以有效抑制NPCs内NFE2L2的表达加重ROS诱导的NPCs焦亡。褪黑素预处理上调了NPCs内NFE2L2的表达抑制ROS诱导的NPCs焦亡,而褪黑素受体阻断剂或ML385均可显著减弱褪黑素对ROS诱导的NPCs焦亡的保护作用。结论:转录因子NFE2L2负向调节ROS诱导的NPCs焦亡;褪黑素通过上调NFE2L2改善ROS诱导的NPCs焦亡。