端粒是真核生物染色体末端的一段重复序列,对于保护染色体的完整性必不可少。哺乳动物端粒长度的动态平衡是由许多端粒结合蛋白共同调控的,其中端粒结合因子1（Telomere Repeat Binding Factor 1,TRF1）是最重要的端粒结合蛋白之一。TRF1的过量表达抑制了端粒酶的作用,缩短了端粒长度,而且TRF1能和TIN2、POT1和PTOP结合成蛋白复合物。TRF1在ANLL细胞中的表达明显减低,而在ALL细胞中表达与正常对照比较差异无统计学意义。提示TRF1在ANLL和ALL中发挥不同的调控作用。p53是一个重要的抑癌基因,在各种应激事件引起DNA损伤时,发挥细胞周期阻滞和促进凋亡的重要作用。p53基因突变的Li-Fraumeni综合征患者和p53基因敲除的小鼠发生恶性肿瘤的概率高达50%以上。p53的转录后修饰对于它的激活有重要的作用,例如丝氨酸15位的磷酸化可以促进凋亡和调控G1期检查点。ATM（ataxia telangiectisa mutant）是人染色体突变隐性遗传的毛细血管扩张共济失调症致病基因,参与细胞周期调控、有丝分裂、端粒长度监测及DNA损伤细胞学反应。研究报道,ATM蛋白磷酸化TRF1蛋白的219位氨基酸,并能够抑制TRF1的促凋亡作用。在AS2O3处理的胃癌细胞中,可以检测到TRF1、TRF2蛋白含量的增加,引起细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,同时伴有p53含量的增加,但是具体影响p53蛋白表达的途径并不明确。对胃肠道肿瘤模型小鼠的研究证实了端粒缩短对上皮细胞来源肿瘤的影响。在大肠癌的癌前病变家族性腺瘤性息肉的病人中发现了APC肿瘤抑制基因的突变。杂合型APC(APCmin+/-)和APC突变型小鼠均有高比率的胃肠道腺瘤发生,端粒酶缺失的杂合型APC小鼠腺瘤发生率显著低于APC杂合型小鼠,并且p53蛋白水平同时增高。最近的研究证实,端粒缩短可以激活p53,引起G1期检查点被激活及细胞周期停滞。对TERC-/-成纤维细胞的研究说明,端粒缩短后激活p53的信号通路涉及到p53对细胞周期的阻滞。TERC-/-与p21-/-均缺失的小鼠和TERC-/-缺失,但是p53+/+的小鼠相比,肿瘤易感性增强,易患肿瘤类型也发生了改变。这些实验结果也提示,端粒缺失引起的p53激活后,需要p21参与的细胞周期调控来抑制肿瘤的生成。在p53活化引起细胞周期阻滞的人类细胞中,观察到p21蛋白水平增高。在人类成纤维细胞中p21的失活能延长细胞的存活时间,证明p21确实是一个重要的p53途径中的信号因子。端粒失活在p53引起的G1期检查点激活中的作用和信号通路还需要更多的实验进一步的研究。国际上尚未有人报道p53和TRF1有直接的相互作用。因此,本研究以TRF1对p53和ATM功能调节为研究对象,并试图阐明TRF1在细胞周期调节途径中的作用及其作用机理。第一部分,TRF1与p53的相互作用。本课题的研究在国际上首次证明了端粒结合因子1在体内和体外与p53相互作用。用TRF1作为诱饵筛选到了它的相互作用蛋白质p53。为了证实TRF1与p53的相互作用,进行了GST pulldown以及免疫共沉淀实验,验证了TRF1在体内和体外都与p53相互作用。并且TRF1和p53的结合区域在p53的C端。在有丝分裂期细胞中,TRF1和p53都有中心体定位。两者在中心体上的共定位更进一步证实了它们之间的相互作用,也提示了它们参与了中心体的功能。TRF1 siRNA敲除后,p53在有丝分裂期的中心体定位并不消失。说明TRF1对于p53的中心体定位不是必须的。第二部分,TRF1对p53的作用及其机理研究。为了进一步阐明TRF1在p53依赖的细胞周期检查点和凋亡信号途径中所发挥的作用,我们构建了p53的模拟磷酸化和非磷酸化状态的突变体GFP-p53S15D和GFP-p53S15A,并进行了免疫共沉淀、免疫印迹和免疫荧光实验。免疫共沉淀和Pulldown实验证实了GFP-p53S15A和GFP-p53S15D在体内和体外都能和TRF1相互作用。荧光显微镜下观察到UV胁迫后,TRF1和p53S15在U2OS细胞核中有共定位。这些结果提示了TRF1和p53的稳定和丝氨酸15位的磷酸化密切相关。而且进一步的免疫印迹结果表明TRF1能增强p53丝氨酸15位的磷酸化和p21的蛋白水平。TRF1对p21的直接作用国际上还未见相关报道,在检测TRF1对p21基因启动子活性的影响时,萤火虫萤光素酶实验发现TRF1确实能够增强p53对p21启动子的转录激活活性。综上所述,实验结果证实了TRF1能够增强p53丝氨酸15位的磷酸化和对CDK抑制因子p21的转录激活,从而调控细胞周期,并行使抑制肿瘤细胞生长的重要功能。端粒功能失调和细胞衰老与肿瘤发生密切相关,是近年来肿瘤研究的热点,以上实验结果提示了TRF1通过p53信号途径影响细胞周期调控,并可能进而调控肿瘤的发生与发展。第三部分,TRF1对ATM的作用及其机理研究。TRF1 219位丝氨酸是ATM激酶的磷酸化位点,为了进一步研究TRF1对细胞周期调控的作用,我们构建了TRF1的模拟磷酸化和非磷酸化状态的突变体GFP-TRF1S219D和GFP-TRF1S219A。测序证实了突变成功,GFP抗体免疫印迹证实了突变体蛋白质能够在真核细胞中正确表达。另外荧光显微镜下观察到TRF1S219A-GFP和TRF1S219D-GFP均呈点状定位于细胞端粒,说明丝氨酸219位的突变并不影响TRF1和端粒的结合。而且转染野生型和突变体后HeLa细胞中ATM蛋白含量均比对照组增高。流式细胞仪结果显示,过表达TRF1野生型和非磷酸化突变体的HeLa细胞产生G2/M期的阻滞（P＜0.05）。以上实验结果提示ATM激酶对TRF1丝氨酸219位的磷酸化可以抑制由于TRF1过量表达而引起的细胞周期G2/M期的阻滞。本研究构建了TRF1非磷酸化和模拟磷酸化突变体,并在国际上首次证实了TRF1磷酸化突变体对细胞周期的影响,有助于进一步研究TRF1对有丝分裂和肿瘤发生的作用,也为阐明端粒蛋白质相互作用网络奠定了基础。