研究证明，缺乏共刺激信号是肿瘤细胞逃避免疫监视的重要原因之一。机体抗肿瘤的免疫必须依赖于肿瘤细胞的抗原被机体免疫系统识别，方能激活。但人类肿瘤免疫原性弱，且抗原呈递中存在多个环节缺陷，使肿瘤逃避机体免疫识别。因此，若能将免疫相关基因导入肿瘤细胞制备肿瘤疫苗，可增强肿瘤细胞抗原性以及抗体对肿瘤抗原的识别和呈递能力，增强机体抗肿瘤免疫能力。CD80是表达于活化的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞和NK细胞等有抗原呈递作用的细胞上的糖蛋白，与其配体CD28结合，在T细胞活化中起协同刺激作用。但是目前研究表明，除少数的B淋巴瘤外，肿瘤细胞表面并不表达CD80分子。不表达CD80分子的肿瘤细胞即使有免疫原性，仍不能有效地诱导T细胞活化，甚至产生特异的无反应性。细胞表达CD80分子后具有免疫原性，被CD8⁺T前体CTL细胞识别时，肿瘤抗原MHC-Ⅰ类分子复合物提供第一信号，而CD80分子通过与T细胞表面的CD28作用提供第二信号。CD8⁺T细胞识别这一双信号后即活化并分泌IL-2等细胞因子，进而增殖分化形成效应CTL，发挥溶细胞功能，杀灭肿瘤。对于能自发退化的肿瘤，其机制也是肿瘤细胞表达了CD80，并与CD28相互作用诱导了抗肿瘤免疫。因此，导入CD80基因的癌细胞表达CD80后，变成了具有免疫原性的肿瘤细胞，可以有效的刺激抗肿瘤免疫。不但能使肿瘤细胞失去其成瘤性，而且能通过诱导全身特异的肿瘤免疫反应，排斥远隔部位的CD80^-的同一肿瘤。但是由于CD80基因直接导入目的肿瘤细胞内表达的传统的基因转导法存在许多的限制：1．需要外源性载体，而病毒等载体进入患者体内，其活动范围，活动过程都无法控制，很可能带来不良反应；2．患者体内进行基因转染，因受体内生理微环境条件的限制，其转染效率往往较低；3．基因表达的过程复杂且耗时；4．外源性基因整合到宿主细胞核染色体后，往往容易降解，或者表达不稳定，所以目前很难运用于临床。随着人们对糖基化磷脂酰肌醇（Glycosyl phospharidyl inositol，GPI）锚定信号认识的不断深入，人们开始利用GPI锚将蛋白锚定于细胞表面而发挥肿瘤疫苗的作用。GPI锚定蛋白没有跨膜区和胞内部分，不跨越细胞膜脂质双分子层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上。当GPI锚定蛋白与细胞共同孵育时，可以自动整合到细胞膜表面，并可以保持与其天然配体结合的能力。利用GPI的上述结构功能特点及CD80的抗肿瘤功能，将CD58的羧基末端肽链编码序列和CD80的胞外编码序列进行体外基因重组（CD58的羧基末端肽链含ω位点，其表达产物为GPI锚定蛋白），接着在真核表达体系中表达，通过纯化后得到GPI锚定形式的CD80。通过GPI结构将CD80分子锚定于肿瘤细胞表面并保持CD80原有的共刺激功能，用这种方法制成的肿瘤疫苗突破了以往基因转染的耗时、低效、不稳定及潜在危险的局限，是一种高效、安全的新型疫苗，为肿瘤的免疫治疗提供了一种全新的途径。目的1．将pRM10／GPI-CD80真核表达质粒在CHO细胞中表达，经过筛选后得到稳定表达GPI-CD80基因的CHO细胞。2．提取稳定表达GPI-CD80的CHO细胞膜蛋白，免疫亲和层析法分离纯化出GPI-CD80蛋白，并对纯化所得到的蛋白进行鉴定。3．研究GPI-CD80融合蛋白的抗肿瘤作用及其机理。方法1．用脂质体Lipofectamine^TM 2000分别将载体pRM10和pRM10／GPI-CD80转染至CHO细胞。转染细胞在G418选择培养基中经过加压筛选，得到稳定表达GPI-CD80的CHO细胞株后，利用免疫荧光技术对表达于CHO细胞膜的CD80分子进行检测；利用流式细胞技术检测在CHO细胞膜表达CD80分子的荧光阳性细胞数。2．提取稳定表达GPI-CD80蛋白的CHO细胞的膜蛋白后，选用鼠抗人CD80单抗，通过与溴化氢活化的Sepharose 4B藕联制备亲和层析柱，分离纯化GPI-CD80膜蛋白。利用Western-Blot对GPI-CD80融合蛋白进行鉴定；PIPLC处理稳定表达GPI-CD80的CHO细胞，流式细胞仪检测处理前后细胞膜上CD80蛋白的表达情况，判断蛋白是否为GPI锚定形式；将HepG2细胞与GPI-CD80蛋白共培养，通过流式细胞仪检测与GPI-CD80融合蛋白共培养不同时间点HepG2细胞表面的荧光阳性细胞率，鉴定GPI-CD80融合蛋白的锚定稳定性。3．将纯化后的GPI-CD80融合蛋白与HepG2细胞共培养后用丝裂霉素灭活，制备肿瘤疫苗，以单纯丝裂霉素灭活的HepG2设为对照。将两组疫苗与小鼠脾淋巴细胞共培养，分别在0h、24h、48h、72h，MTT法检测肿瘤疫苗对正常小鼠脾淋巴细胞增殖影响；MTT法检测脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ的OD值；利用乳酸脱氢酶法检测对CTL的活性影响；将HepG2细胞接种于裸鼠，第4d后再将各组肿瘤疫苗分别注射于荷瘤小鼠皮下，设PBS为空白组，丝裂霉素灭活的HepG2为阴性对照组，每3d检测荷瘤小鼠肿瘤体积。4．统计分析：统计分析软件为SPSS11.5版。两组间IL-2、IFN-γ、CTL的水平的比较采用随机设计资料的t检验。不同组、不同时间点之间T淋巴细胞OD值、肿瘤体积的比较采用重复测量数据的方差分析。如P＜0.05，则进一步行组间、时间点间LSD两两比较（方差齐时）或Tambane’s T2两两比较（方差不齐时）。结果1．在CHO细胞中加入G418后，不同G418浓度条件下的CHO细胞发生了不同程度的死亡。培养至第14d，浓度为800μg／ml，900μg／ml，1000μg／ml的G418均可将CHO细胞杀死，而浓度为400μg／ml，500μg／ml，600μg／ml，700μg／ml的G418未能杀死全部细胞，故确定浓度800μg／ml的G418为CHO细胞在10％胎牛血清浓度下的筛选浓度。用阳性脂质体法将pRM10／GPI-CD80转染至CHO细胞。转染细胞在G418选择培养基中筛选后得到了稳定表达GPI-CD80的CHO细胞株；免疫荧光化学法显示该细胞株的膜上有强烈的绿色荧光，而对照组中转染了pRM10质粒的CHO细胞膜上未见荧光。表明GPI-CD80融合蛋白是锚定在细胞膜上的；流式细胞仪检测筛选得到的CHO细胞，细胞膜上表达GPI-CD80的阳性细胞率和平均荧光强度分别高达90.02％，42，而对照组阳性率和荧光强度均极低：CHO细胞的阳性标记率和平均荧光强度分别为0.50％，3，转染了pRM10的CHO细胞阳性标记率和平均荧光强度分别为8.95％，10。2．经过免疫亲和层析，得到纯化的GPI-CD80融合蛋白。Western-Blot显示在60KD附近有一明显的褐色蛋白条带出现；将CHO细胞、转染了pRM10的CHO细胞、稳定表达GPI-CD80的CHO细胞用胰酶消化后以PBS重悬，加入鼠抗人FITC-CD80抗体，流式细胞仪检测各样本中CD80荧光阳性标记细胞的阳性率及平均荧光强度。结果显示CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为0.47％，2，转染了pRM10的CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为7.62％，9，稳定表达了GPI-CD80的CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为90.02％，42。将这些细胞用PIPLC处理4h后再进行流式细胞仪检测，可见两个对照组的CD80细胞阳性率和平均荧光强度几乎没有发生改变，而稳定表达了GPI-CD80的CHO细胞阳性标记率和平均荧光强度分别改变为6.34％，7。说明在稳定表达GPI-CD80的CHO细胞表面表达的蛋白为GPI锚定蛋白。GPI-CD80融合蛋白与HepG2细胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式细胞仪检测细胞表面呈现荧光的CD80阳性细胞率分别为78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各样本进行比较，阳性细胞数百分率变化不明显，表明GPI-CD80融合蛋白与HepG2肿瘤细胞共孵育后，能够锚定在肿瘤细胞膜上，而且这种锚定较稳定。3．小鼠脾淋巴细胞在经过制备的肿瘤疫苗刺激后，OD值上升，作用24h、48h、72h时的OD值分别为0.44±0.14、0.66±0.03、0.99±0.27，与HepG2组相比差异显著（F=63.958，P=0.000），各时间点间也有显著差异（F=51.912，P=0.003）；对各组小鼠脾淋巴细胞培养液中IL-2、IFN-γ含量的检测结果可见，肿瘤疫苗组IL-2和IFN-γ的量分别为115.94±3.57，261.96±19.06，与HepG2组相比有显著差异（P=0.000）；在对肿瘤疫苗刺激淋巴细胞后CTL活性的检测中，肿瘤疫苗组CTL的水平明显高于阴性对照组，有显著差异（t=11.37，P=0.000）。荷瘤小鼠在接受肿瘤疫苗治疗后，各组间肿瘤体积大小差异显著（F=801.801，P=0.000），从大到小依次为：空白对照组、阴性对照组、阳性组。结论1．pRM10／GPI-CD80在CHO细胞中成功表达，经过G418抗性筛选得到了稳定表达GPI-CD80的CHO细胞株。2．实验得到的GPI-CD80蛋白具有稳定的膜锚定功能。3．免疫亲和纯化法可获得有活性的GPI-CD80蛋白。4．融合蛋白能够抑制肿瘤的生长速度，其机制可能与扩增T淋巴细胞、刺激淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ，增强CTL活性等有关。