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scFv-507抗体是针对MCF-7细胞筛选得到的一株单链抗体,该抗体能特异性的识别MCF-7细胞,而与正常细胞的反应较弱。本研究的目的是分析scFv-507抗体的肿瘤特异性,并通过质谱技术和噬菌体肽库筛选技术鉴定scFv-507抗体所识别的抗原。首先,为了获得纯的scFv-507抗体,我们将scFv-507基因连同其5’端的pⅢ蛋白的信号肽编码序列一起克隆到pET-24a表达载体中,构建了scFv-507分泌性表达载体,该载体表达的scFv-507被直接分泌到细菌的周质中,避免了以包涵体形式表达后必须进行的蛋白复性过程。在该表达载体中我们保留了原表达载体中的（His）。标签,该标签表达于目标蛋白的C末端,由于该标签较小,一般不会影响目标蛋白的功能,而该标签的存在还可以利用Ni2+螯合层析法方便地进行目标蛋白的纯化。利用Ni2+螯合层析法纯化,得到了纯度大于90%的scFv-507抗体。我们用纯化的scFv-507抗体、采用细胞ELISA技术和FACS技术分析了scFv-507所识别的抗原在各种肿瘤细胞中的表达情况。细胞ELISA的结果表明,scFv-507所识别的抗原在MCF-7乳腺癌细胞和HepG2肝癌细胞中高表达,而正常细胞中该抗原表达较弱。FACS结果表明,三种不同来源的乳腺癌细胞系中scFv-507抗体所识别抗原的表达存在较大差异,在MCF-7细胞中,该抗原表达于90%的细胞中,在MD-MAB-231细胞中,表达该抗原的细胞约占一半,而在SK-BR-3细胞中,表达该抗原的细胞数最低,仅为13.6%。在SK-OV-3卵巢癌细胞中,有76.8%的细胞表面表达scFv-507抗原,略低于MCF-7细胞。HepG2肝癌细胞中scFv-507抗原阳性细胞占59%。但在GLC82肺癌细胞中,该阳性细胞的比例仅为9.98%,与L02等正常细胞中阳性率基本一致。但是,肺纤维细胞系中该比例最低,仅为1.16%。该抗原的表达是否与细胞的变异相关,尚不清楚。为了鉴定scFv-507抗原,我们首先抽提了MCF-7细胞的蛋白质,由于scFv-507抗原是细胞表面抗原,因此,我们在细胞裂解液中加入了高浓度的去污剂,这样能保证对膜蛋白进行有效抽提。将抽提的蛋白分为可溶性部分和沉淀部分,将这两部分均用作后续抗原鉴定的起始材料。通过一维电泳和Western blot,在可溶性蛋白组分中找到了一种能够被scFv-507抗体识别蛋白质,其分子量约为10kD。我们从PVDF膜上将该蛋白条带切下,使用酸解吸液将膜表面与抗原结合的scFv-507抗体洗去,然后用胰蛋白酶将靶蛋白条带中的蛋白质切割成不同大小的肽段,再进行,通过MALDI-TOF鉴定肽段,将肽段鉴定结果进行数据库的检索,可信度≥95%的蛋白仅有一个,为G protein-regulated inducer of neurite outgrowth 1（GRIN1）,分子量大约为102308。GRIN1是一种特异表达于脑中的蛋白质,与活化的Gi亚家族的α亚基相互作用。但尚不清楚GRJN1与肿瘤发生、发展是否存在相关性。由于质谱鉴定的蛋白的可信性只说明被鉴定的蛋白条带或蛋白点中含有该蛋白的可能性。而对于Western blot膜上阳性条带的质谱鉴定得到具有高可信性的蛋白,并不一定是抗体所识别的靶抗原,所以,需要借助于其他技术进行进一步验证。噬菌体肽库技术在寻找抗体所识别的表位中有独特的优势,幸运的话,从肽库中筛选出来的表位将会与抗体所识别的靶蛋白中相应的表位存在很高的同源性,从而可以确定抗体所识别的抗原。为了进一步鉴定验证scFv-507抗原,我们又利用噬菌体展示肽库来筛选scFv-507抗体的抗原表位。一般情况下,肽库筛选所用的靶蛋白是直接包被到酶联板等介质上的,这样可能造成蛋白的部分变性,从而影响结合肽的筛选。为了避免这种现象,我们采用ProteinA/G液相捕获法固定scFv-507抗体,然后进行结合肽的筛选。但scFv-507抗体是单链抗体,没有Fc段,因此不能被ProteinA/G琼脂糖所直接捕获。但我们表达的scFv-507抗体的C末段带有（His）。标签（His-Tag）,因此,我们利用抗His-Tag的抗体捕获scFv-507,再用ProteinA/G琼脂糖捕获His-Tag/scFv-507/靶噬菌体。通过这种方式对噬菌体肽库进行了4轮筛选,其回收率从第一轮的6.7×10-5上升到第四轮的1.6×10-2,,说明那些表面展示能被scFv-507特异识别小肽的噬菌体得到了有效富集。从第四轮中随机挑选了10个克隆进行测序,其中5个具有一致序列AQALHHH,还有2个具有一致序列QHHLWPE,但这两个序列均未在利用质谱技术得到的候选蛋白GRIN1中发现其同源序列。但这两个一致性序列都包含LHH（或HHL）核心序列,将这两个序列对人蛋白质数据库进行比对后并没有发现可能的靶蛋白。所以,要想最终准确鉴定出scFv-507所识别的抗原,还需要采用其他的技术方法。总之,通过本研究我们实现了scFv-507的分泌性表达,得到了高纯度的scFv-507抗体,分析了scFv-507抗原在各种肿瘤细胞中的表达,表明scFv-507抗原具有一定的肿瘤特异性。通过质谱技术得到了scFv-507抗体的一种候选抗原蛋白GRIN1,通过筛选噬菌体肽库得到了scFv-507识别的两个可能的表位。但scFv-507识别的真正抗原还需要更进一步的实验验证。