热休克蛋白(HSPs,也称为应激蛋白)是一个高度保守的蛋白质家族，广泛分布于现知的所有活体组织内。活细胞在生理情况下构成性表达该类蛋白，当曝露于某些应激状况，如：热休克、营养剥夺、病毒感染时，表达明显增强。真核细胞内的热休克蛋白分子量从10kD～100kD大小不等，其中具有代表性的是HSP90、HSP70和HSP60。在生理情况下，热休克蛋白与错误折叠／未折叠的蛋白质相互作用，而参与其细胞内的折叠、装配和转位，因而也被称为“分子伴侣”蛋白或多肽链结合蛋白。 热休克蛋白70(HSP70)家族是热休克蛋白中最具代表性的一种，在进化过程中高度保守。不同来源的HSP70有相似的生化特征，研究发现，大肠杆菌内的HSP70与其真核细胞中类似物比较，其氨基酸组成有40％-50％的同源性，在核酸序列上则有50％-95％的同一性。哺乳动物细胞的 第四军医大学硕土学位论文 HSP70 家族成员中最具特色的主要有四种：（l）HSC70（heat shock cognate 70），为正常生理状况下构成性表达。（2）HSP70，在应激情况下 大量表达。（3）Bip（或grp70），定位于内质网。（4）定位于细胞线粒体 基质的 HSP70。不同的 HSP70在细胞内行使不同的功能：（1）促进某些蛋 白质至合适的位置进行折叠或装配。（2）参与细胞内多肽向细胞器的转 位。（）参与靶向变性蛋白至溶酶体溶解。（4）溶解不溶性蛋白聚集 物。诱导型HSP70除具有与构成性表达型相似的功能外，还具有一些与应 激相关的功能，如：参与应激情况下产生的变性蛋白聚集物的折叠和溶 解，及参与不可逆损伤蛋白的转位而行使“分子伴侣”功能。 尽管人们对HSP70进行了广泛的研究，对其作用机制仍然知之甚少。 现知HSP70有两个结构域：一个是氨基酸末端腺嘿吟核昔酸结合结构域， 另一个是竣基末端多肽结合结构域。当有合适的蛋白底物，如：合成多肽 时，一些HSP70亚型可显示出微弱的 ATP酶活性。多肽与 HSP70的结合需 要MP的参与，而当其与肝P结合时，可促进HSP70与多肽的解离。通过 这种核酸依赖性多肽结合和解离过程，可导致蛋白质的正确折叠，HSP70的一 些其它功能可能也与此过程相关。 热休克蛋白同时也是很多细菌和寄生虫感染性疾病中的优势抗原。在 很多疾病，如：疟疾、锥形虫症、美洲利什曼病、血吸虫病、丝虫病等患 者的血清中可检测出HSP70抗体。另外，在一些寄生虫感染和自身免疫性 疾病中还发现了针对HSP70家族成员的T细胞应答反应。 一些热休克蛋白己经成为免疫抑制药的靶标，如：一种强效兔疫抑制 剂脱氧精肌菌素，显示出明确的与HSC70结合活性。近年来，人们研究发 现，当一些多肽抗原与HSP70非共价结合时，HSP70可起到载体分子的作 用，而激起机体对该多肌的免疫反应。另外，细胞在应激状态下诱导表达 HSP70，可激起机体产生针对相似或其它形式应激的细胞保护作用。这种细 胞保护机制在缺血和神经元损伤造成的组织损伤中研究比较深入。 为了进一步研究热休克蛋白70的结构和功能，及其在免疫应答反应和 细胞保护作用中的机制，我们克隆并原核表达了人热休克蛋白 70（诱导 型）基因，并开发出一套纯化该蛋白的方法。本研究包括三部分： （一）人HSP70基因的克隆与测序 从热休克后的人肝癌细胞株SWC－ 7721中提取细胞总队A，RT－PCR合成c0NA第一链，以其为模板PCR扩增 ·6· 第四军医大学硕士学位论文 一 HSP70 目的片段。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定结果表明，从人肝 癌细胞株SWC－7721扩增得到了长度约1．gkb的DNA扩增片段。将该扩增 片段纯化后行全基因的全自动序列分析。全基因的全自动序列分析结果与 GeneBank所报道的人HSP70基因序列相一致。 （二）人HSP70基因的原核表达 将测序鉴定后HSP70的基因片段经 ECORI和PStl双酶切回收，并与经同样限制酶双酶切的带有T7启动子的高 效原核表达质粒叩－30相连接，建立原核表达载体叩－30HSP70，转化大 肠杆菌川109，将含有表达载体的菌落接种在LB培养基（含100。g几氨节 青霉素）中培养，培养至A值约为0．4－0．6，37丫加诱导剂IPTG至终浓度 为lrnmol儿，并继续培养Zh。4丫，以3，0009速度超速离心10。in收集细胞， 细胞裂解后经SDS－PAGE检测表达产物。结果显示，重组pQE－30HSP70转化 的大肠