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手性双醇作为许多手性催化剂和手性药物的关键原料，在精细化工、农药化学及制药行业有广泛的应用。(2S,5S)-2,5-己二醇是抗高血压药卡托普利和地尔硫卓的重要中间体，也是合成手性膦配体的手性砌块。目前，国内外主要用手性钌催化剂不对称还原2,5-己二酮来制备(2S,5S)-2,5-己二醇，利用生物催化法制备(2S,5S)-2,5-己二醇鲜有报道。随着“绿色化学”潮流的掀起，利用生物催化技术反应条件温和、绿色环保、经济高效、对映选择性高等优点，实现手性双醇的一步法制备具有重要的应用前景。本论文以生物催化法制备手性双醇为目的，通过筛选合适的生物催化剂、探索合理的固定化生产工艺，以期实现生物催化法制备(2S,5S)-2,5-己二醇。主要研究结果如下：
1.以2,5-己二酮为底物，从酵母菌库中筛选到一株对底物催化效率较高的菌株SaccharomycescerevisiaeZJUT-D9，并采用单因素优化实验对该菌的发酵条件和转化条件进行优化。确定最优发酵条件为：葡萄糖25.0g/L，NH4Cl30.0g/L，NaH2PO42.0g/L，NaCl1.0g/L，CaCl20.11g/L，FeCl30.16g/L，pH6.5，30℃，200r/min发酵26h。最优转化条件为：200g/L湿菌体，10mLPBS缓冲液(pH 7.0，0.1 M)，59.5mM2,5-己二酮(底物)，0.1gL-酪氨酸(辅助底物)，0.5g麦芽糖(辅助底物)，30℃，200r/min恒温摇床震荡反应24h。最优条件下，该菌的生物量、比酶活和产率达到了9.12g/L、0.113U/gcell和15.9%，相较于初始条件，生物量提高了24.4%，比酶活提高了370.8%，产率提高了89.3%。优化过程中ee值始终大于99%。
2.建立了细胞固定化材质γ-聚谷氨酸(Poly-gamma-glutamicacid，γ-PGA)的纯化工艺，首先，对该工艺的表观现象进行了考察，证实了利用溴代十六烷基吡啶(cetylpyridinium bromide，CPB)提纯γ-PGA的可行性。接着，采用单因素优化实验对该工艺中两个关键因素进行优化。确定最优工艺条件为：50mL2%(w/v)γ-PGA粗品溶液与30mL5%(w/v)CPB水溶液结合过夜，10mL无水乙醇溶解沉淀，20mL30%(w/v)NaCl水溶液置换出γ-PGA醇沉物，洗涤、透析并冻干。最优工艺条件下，可将含量为5%的γ-PGA粗品纯化至30%，回收率为81%(用传统的乙醇沉淀法对γ-PGA粗品进行纯化，可将含量5%的γ-PGA粗品纯化至17%，回收率为88%)。相较而言，使用CPB纯化γ-PGA更经济且得到的产品纯度更高，为γ-PGA的纯化提供了新思路。
3.用γ-PGA和ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，ε-PL)自组装得到的纳米颗粒对SaccharomycescerevisiaeZJUT-D9进行固定化，将固定化细胞应用于(2S,5S)-2,5-己二醇的制备中，并用单因素优化实验对固定化反应条件和固定化转化条件进行优化。确定最优固定化反应条件为：γ-PGA和ε-PL总质量比3%(w/w)，投料比2∶1，搅拌转速300r/min。最优转化体系和温度为：0.9%NaCl水溶液(pH 8.0)，37℃。在最优条件下，固定化酵母细胞催化制备(2S,5S)-2,5-己二醇的产率达到16.2%，重复4个批次产率仍保留62.5%。相较而言，固定化细胞产率更高且可重复利用，证明了自组装纳米材料生物相容性好，在固定化方面有良好的应用前景。
1.以2,5-己二酮为底物，从酵母菌库中筛选到一株对底物催化效率较高的菌株SaccharomycescerevisiaeZJUT-D9，并采用单因素优化实验对该菌的发酵条件和转化条件进行优化。确定最优发酵条件为：葡萄糖25.0g/L，NH4Cl30.0g/L，NaH2PO42.0g/L，NaCl1.0g/L，CaCl20.11g/L，FeCl30.16g/L，pH6.5，30℃，200r/min发酵26h。最优转化条件为：200g/L湿菌体，10mLPBS缓冲液(pH 7.0，0.1 M)，59.5mM2,5-己二酮(底物)，0.1gL-酪氨酸(辅助底物)，0.5g麦芽糖(辅助底物)，30℃，200r/min恒温摇床震荡反应24h。最优条件下，该菌的生物量、比酶活和产率达到了9.12g/L、0.113U/gcell和15.9%，相较于初始条件，生物量提高了24.4%，比酶活提高了370.8%，产率提高了89.3%。优化过程中ee值始终大于99%。
2.建立了细胞固定化材质γ-聚谷氨酸(Poly-gamma-glutamicacid，γ-PGA)的纯化工艺，首先，对该工艺的表观现象进行了考察，证实了利用溴代十六烷基吡啶(cetylpyridinium bromide，CPB)提纯γ-PGA的可行性。接着，采用单因素优化实验对该工艺中两个关键因素进行优化。确定最优工艺条件为：50mL2%(w/v)γ-PGA粗品溶液与30mL5%(w/v)CPB水溶液结合过夜，10mL无水乙醇溶解沉淀，20mL30%(w/v)NaCl水溶液置换出γ-PGA醇沉物，洗涤、透析并冻干。最优工艺条件下，可将含量为5%的γ-PGA粗品纯化至30%，回收率为81%(用传统的乙醇沉淀法对γ-PGA粗品进行纯化，可将含量5%的γ-PGA粗品纯化至17%，回收率为88%)。相较而言，使用CPB纯化γ-PGA更经济且得到的产品纯度更高，为γ-PGA的纯化提供了新思路。
3.用γ-PGA和ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，ε-PL)自组装得到的纳米颗粒对SaccharomycescerevisiaeZJUT-D9进行固定化，将固定化细胞应用于(2S,5S)-2,5-己二醇的制备中，并用单因素优化实验对固定化反应条件和固定化转化条件进行优化。确定最优固定化反应条件为：γ-PGA和ε-PL总质量比3%(w/w)，投料比2∶1，搅拌转速300r/min。最优转化体系和温度为：0.9%NaCl水溶液(pH 8.0)，37℃。在最优条件下，固定化酵母细胞催化制备(2S,5S)-2,5-己二醇的产率达到16.2%，重复4个批次产率仍保留62.5%。相较而言，固定化细胞产率更高且可重复利用，证明了自组装纳米材料生物相容性好，在固定化方面有良好的应用前景。