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犬腺病毒病(Canine adeno,CA)是由犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)感染引起的一种传染性疾病,本病广泛流行于家养犬、狐狸、郊狼和浣熊等动物中。犬自然感染CAV的发病率大于50%,死亡率高达25-40%。CAV常与犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(Canine parvo virus,CPV)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)等混合感染,增加了临床症状的复杂性。本研究通过对武汉部分宠物医院疑似CAV、CDV、CPV、CPIV感染的患病犬进行病毒的分离鉴定,分离获得4株CAV-Ⅱ毒株,1株CPV2b毒株,同时构建了CAV-ⅡWH-27分离株的全基因组文库,为CAV的流行病学调查及预防和控制CAV相关疾病提供参考数据。具体研究内容如下:1、犬源病毒的分离与鉴定从武汉部分宠物医院收集患病犬病料样品410份,选择85份病料样品接种MDCK细胞,有13份接种细胞后发生明显、稳定的细胞病变,表现为细胞肿胀变圆、聚集,呈"葡萄串"状或分散变圆的特征性病变。分别通过CAV、CDV、CPV、CPIV特异性引物对13份细胞病变样品进行PCR/RT-PCR鉴定,结果表明,其中4份样品(编号:27、162、201、208)扩增出1030bp的特异性片段。序列比对和同源性分析表明,27号、162号样品与CAV-Ⅱ标准毒株Toronto A26/61的同源性均为99%;201号、208号样品与CAV-Ⅱ标准毒株Toronto A26/61的同源性均为97%,表明有4株分离病毒为CAV-Ⅱ,分别命名为:WH-27,WH-162,WH-201,WH-208。另外,182号样品扩增出576bp的特异性片段,序列比对和同源性分析表明该毒株与CPV2b毒株BM(11)VP2的同源性为100%,表明182号样品的分离病毒为CPV2b型,命名为:WH-182。通过CDV、CPIV特异性引物的扩增结果均为阴性。电镜结果显示,CAV-Ⅱ WH-27病毒的病毒粒子的直径为60.67nm,形态为六边形,有明显的纤突,呈二十面体立体对称;WH-182病毒粒子直径在20-26nm之间,外观呈圆形,大多为实心,部分为空心。2、CAV-Ⅱ WH-27毒株基因组文库的构建用限制性内切酶Hind Ⅲ分别酶切CAV-ⅡWH-27分离株基因组DNA和载体pBlueScriptⅡSK(+),回收病毒基因组不同Hind Ⅲ片段和载体片段,进行连接获得不同片段的重组质粒。随机挑取100个单菌落,提取重组质粒并经Hind Ⅲ酶切鉴定、测序。获得了 CAV-ⅡWH-27不同Hind Ⅲ片段的核苷酸序列。通过PCR方法扩增一些没有拼接上的片段,最终获得了 CAV-Ⅱ WH-27分离株全基因组序列。